马铃薯液体间歇浸没培养研究

马铃薯液体间歇浸没培养研究

通常，半固体苗的栽培强度高，成本高。静液体培养具有适应性强、成本低等特点，但玻璃形苗等生理问题严重。因此,两种方法都无法实现提高效率和降低成本的市场化要求。因此,改善培养工艺,建立新的培养方法体系,减少劳动力耗费,实现自动化培养是降低成本实现商业化生产的一种趋势。最早使用微生物发酵罐来进行植物组织培养,但是由于成本以及植物的特点的限制而失败。自20世纪80年代中期开始,西方国家开始了大规模液体浸没组织培养的研究,到90年代中后期取得了突破性进展,为商业化生产苗木打下了坚实的基础。国内研究起步晚,且主要集中在次生代谢产物的生产上,而且目的在于降低成本。目前,有关马铃薯商业化生产的大规模液体组织培养研究尚未有报道。液体间歇浸没式繁殖在辰星草、甘蔗、苹果、香蕉等植物上已显示出效率高、成本低的优势,在马铃薯快繁及育种方面也应具有巨大的应用潜力。Feuser等发现,与传统固体培养相比,马铃薯液体间歇浸没培养生长周期缩短20%～25%,茎粗、株高、叶面积、干重等指标均有显著提高。为此,笔者对马铃薯组培苗间歇浸没培养进行研究,探求马铃薯间歇液体培养快繁最优方案,充分利用空间、减少营养液浪费,降低成本,为今后实现自动化大规模生产提供理论基础。1材料和方法1.1材料和培养方法本试验所用材料为江苏农林职业技术学院农艺系组培室提供,所用马铃薯为夏泊蒂(Shepody)和费乌瑞它(Favorita)2个品种,所用培养装置为TIBs系统,所用培养瓶规格为30cm×154cm。1.2试验设计1.2.1接种苗的培养设计4个处理,处理1:间歇浸没培养,品种夏伯蒂;处理2:固体培养,品种夏伯蒂;处理3:间歇浸没培养,品种费乌瑞它;处理4:固体培养,品种费乌瑞它,每个处理3次重复。把试管苗的单节切段转入不同处理的培养基(pH值5.8)中,每瓶培养基160mL,每瓶接种40株,温度(24±1)℃,光照度2000lx,光照时间16h/d。浸没次数1d4次,每次浸没5min。1.2.2浸没设置3次导致治疗4次设计4个处理,处理1:1d浸没2次,每次5min;处理2:1d浸没3次,每次5min;处理3:1d浸没4次,每次5min;处理4:1d浸没5次,每次5min,每个处理3次重复。每瓶培养基(pH值5.8)160mL,每瓶接种40株费乌瑞它试管苗单节切段,温度(24±1)℃,光照度2000lx,光照时间16h/d。1.2.3实验苗的切段设计4个处理,处理1:每瓶40株(即1cm20.26株)费乌瑞它试管苗单节切段;处理2:每瓶60株(即1cm20.39株)费乌瑞它试管苗单节切段;处理3:每瓶80株(即1cm20.52株)费乌瑞它试管苗单节切段;处理4:每瓶100株(即1cm20.65株)费乌瑞它试管苗单节切段。每瓶培养基160mL,温度(24±1)℃,光照度2000lx,光照时间16h/d。1d浸没4次,每次5min。1.2.4营养液的制备设计4个处理,处理1:每瓶80mL(即每株2.0mL)营养液;处理2:每瓶100mL(即每株2.5mL)营养液;处理3:每瓶120mL(即每株3.0mL)营养液;处理4:每瓶140mL(即每株3.5mL)营养液。每瓶接种40株费乌瑞它试管苗单节切段,温度(24±1)℃,光照度2000lx,光照时间16h/d。1d浸没4次,每次5min。2结果与分析2.1根数、高效数接种30d后,分别从4个处理中随机挑选15株组培苗,测量其株高、茎粗、有效茎段数、根长、根数。结果(表1)表明,马铃薯在间歇浸没液体培养条件下,其株高、茎粗、有效茎节数、根数均显著强于传统固体培养。其中与传统固体培养相比,间歇浸没液体培养的夏伯蒂株高增高22.3%,茎粗增粗18.3%,有效茎节数增加19.0%,根数增加88.9%;费乌瑞它株高增高16.5%,茎粗增粗23.5%,有效茎节数增加20.6%,根数增加59.4%。这与牛爱国,侯丽娟等做的液体静置培养试验结果基本一致,表明间歇浸没液体培养保留了液体培养接种效率高、营养易于吸收利用的优点。2.2马铃薯表层浸没频率对马铃薯组培苗有效茎节数的影响接种30d后,分别从4个处理中随机挑选15株组培苗,测量其株高、茎粗、有效茎节数。由图1可知,随着浸没频率的增加,马铃薯组培苗的株高、茎粗、有效茎节数均增加,其中1d浸没4次和5次的马铃薯组培苗的株高、茎粗、有效茎节数显著高于1d浸没2次和3次的,1d浸没4次的与1d浸没5次的差异不显著。说明马铃薯间歇浸没液体培养最适频率为1d4次。低于苹果、香蕉、甘蔗、辰星草等植物的浸没频率。2.3对马铃薯生长的影响接种30d后,分别从4个处理中随机挑选15株组培苗,测量其株高、茎粗、有效茎节数。图2显示,与每瓶接种40株相比,每瓶接种60株的组培苗株高和有效茎节数差异不显著,但茎粗有显著降低,下降13.3%;当接种密度增加到每瓶80株和100株时,组培苗株高、茎粗、有效茎节数均极显著下降。显示密度越大越不利于组培苗的生长。这与刘丽敏等对甘蔗的研究结果有所不同,因为甘蔗还须考虑次生代谢产物的稀释与褐化问题。可见,当接种密度为每瓶40株(即0.26株/cm2)时,马铃薯长势最好,最适于壮苗培养。如需节约空间降低成本,接种密度也可增至每瓶60株(即10.39株/cm2),此时对组培苗株高和有效茎节数无影响,只是茎粗相对细一些。2.4两组株高、茎粗、有效茎节数比较接种30d后,分别从4个处理中随机挑选15株组培苗,分别测量其株高、茎粗、有效茎节数。由图3可知,平均给予MS营养液每株3.0mL及其以上时,组培苗株高、茎粗、有效茎节数均差异不显著。当MS营养液量为每株2.0mL时,组培苗株高、茎粗、有效茎节数均与其他处理组差异极显著,与每株2.5mLMS营养液相比,株高降低25.2%,茎粗降低12.1%,有效茎节数减少13.5%。每株2.5mLMS营养液处理与每株3.0、3.5mLMS营养液处理相比,仅株高显著降低外,茎粗和有效茎节数无显著差异。从组培苗生长状况和成本考虑,马铃薯组培苗每株适宜MS营养液量为2.5mL。3营养液量对马铃薯生长的影响试验结果表明,马铃薯组培苗在液体间歇浸没培养条件下,株高、茎粗、有效茎节数、根数均显著强于传统固体培养,与前人在香蕉、甘蔗等植物的研究结果基本一致。在试验中马铃薯适宜的营养液间歇浸没频率为每天4次,接种密度为每瓶40～60株(0.26～0.39株/cm2),每株营养液量为2.5mL。但需研究的因素仍有许多。例如营养液的蔗糖浓度、pH、氮磷钾比例等对马铃薯的快繁也有较大影响。另外,在试验中还发现,培养前期间歇浸没培养的马铃薯组培苗缓苗期明显长于固体培养,生根时间也长于固体培养。其原因可能是生长初期,间歇浸没培养中马铃薯组培苗还未生根,每次浸没后粘附的营养液少,而固体培养中马铃薯组培苗始终与培养基接触吸收营养,故缓苗期短于间歇浸没培养。在组培过程中,污染仍是限定因素。前人试验中,采用较大营养液容器,利用蠕动泵或其他动力机