预处理技术-蛋白质的沉淀（药物分离纯化技术课件）

变性沉淀变性沉淀当蛋白质受到外界因素作用时，蛋白质分子结构从有规则的排列变成不规则排列，其物理性质也发生改变，并失去原有的生理活性，即蛋白质发生变性，变性蛋白质在水中的溶解度较小而以沉淀的形式从溶液中析出。利用蛋白质的变性作用，除去混合液中杂蛋白的方法，称为变性沉淀法。变性沉淀变性沉淀方法加热：利用蛋白质等生物大分子对热的稳定性不同，加热破坏某些组分，而保存另一些组分。加入化学试剂：金属盐、表面活性剂、某些有机酸、酚、卤代烷等可使混合液中的蛋白质或部分蛋白质发生变性而沉淀。调节pH值：当溶液的酸碱性发生剧烈变化时，可引起蛋白质的变性而沉淀。变性沉淀特点使蛋白质溶解度变小，变性沉淀加热法只适用于对热稳定的生化物质加热使液体黏度降低，加快过滤速度变性沉淀是否可逆？常用的方法有哪些？思考题等电点沉淀为什么要进行预处理？发酵液中杂质很多，对后续分离影响最大的是高价无机离子(Ca2+,Mg2+,Fe3+)和杂蛋白等。发酵液中细微颗粒包括悬浮物和胶体颗粒，沉降困难。预处理的条件预处理初步纯化目的产物在胞外细胞破碎目的产物在胞内固液分离发酵液预处理的目的⑴改变发酵液的物理性质，促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离的效率。⑵尽可能使产物转入便于后处理的某一相中(多数是液相)。⑶去除发酵液中部分杂质，以利于后续各步操作。预处理方法的选择药物自身理化性质药物稳定性药物分子量药物的活性预处理的方法沉淀凝聚和絮凝一、沉淀常用的几种方法等电点法变性沉淀法盐析有机溶剂沉淀法反应沉淀法（去除蛋白质和无机金属离子）去除蛋白质导致胶体稳定性的原因方法选择的目的破坏双电层结构破坏水化膜因合并而沉降1.等电点沉淀法等电点（PI）：蛋白质为两性物质，在酸性溶液中带正电荷，碱性溶液中带负电荷，而在某一PH值下，净电荷为零，称为等电点。此时在水中溶解度最小，能沉淀除去。一般羧基电离度大于氨基，所以很多蛋白质的等电点都在酸性范围内（pH4.0~5.5）pH值对蛋白质荷电情况的影响

蛋白质的滴定曲线

不同的蛋白质由于其氨基酸组成的差异，具有不同的等电点（pI），当溶液（环境）pH值低于其pI时，蛋白质带正电荷，而当环境pH值高于其等电点时，蛋白质带负电荷，且偏离等电点越多，其所带电荷越多.沉淀方法：加酸常用酸化剂：硫酸、盐酸、磷酸、草酸等1.等电点沉淀法等电点沉淀法的特点不同的蛋白质，具有不同的等电点同一种蛋白质在不同条件下，等电点不同避免直接用强酸强碱调节PH，引起目的药物成分蛋白或酶的变性各种蛋白质在等电点时，仍存在一定的溶解度，使沉淀不完全，可以考虑采用几种方法结合来实现沉淀分离。反应沉淀5.反应沉淀法定义：在反应液中加入某些不影响目的药物的化学反应试剂，使其与杂质发生反应，生成不溶性沉淀的方法。常用的反应沉淀试剂金属盐类有机酸类表面活性剂离子型或非离子型的多聚物变性剂机理：加入的化学试剂与蛋白质结合形成难溶性的复合物沉淀。应用：除去杂蛋白；除去对提取和成品质量影响较大的无机离子杂质，

主要是Ca2+、Mg2+、Fe3+等高价金属离子5.反应沉淀法盐析沉淀3．盐析沉淀法当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况：（1）“盐溶”现象—低盐浓度下，蛋白质溶解度增大（2）“盐析”现象—高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降盐析机理中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露，由于疏水区的相互作用导致沉淀。盐离子与蛋白质表面具有相反电性的离子基团结合，形成离子对，即盐离子部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间的电排斥作用减弱而相互靠拢、聚集形成沉淀。常用的盐析剂硫酸铵：溶解度大（767g/L）硫酸钠磷酸盐柠檬酸盐盐析的影响因素盐析剂的性质和加入量

（1）符合盐析分布曲线（2）一般阴离子的盐析效果比阳离子好。对于阴离子，带电荷较多者，盐析能力较强，对于阳离子，带电荷较多者，盐析能力较低。盐析的影响因素蛋白质类化合物溶液的浓度：蛋白质浓度大，盐的用量小，但共沉作用明显，分辨率低；蛋白质浓度小，盐的用量大，分辨率高温度：大多数情况下，高盐浓度下，温度升高，其溶解度反而下降。盐析的影响因素pH值：影响蛋白质表面净电荷的数量，通常调整体系pH值，使其在pI附近。蛋白质类化合物的性质：各种蛋白质的结构和性质不同，盐析沉淀的盐浓度、pH、温度等操作条件不同。有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低了亲水性，导致脱水凝聚。利用与水互溶的有机溶剂（如甲醇、乙醇、丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低而沉淀的方法，称为有机溶剂沉淀。常用的有机溶剂沉淀剂乙醇：沉淀作用强，挥发性适中，无毒。常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉淀作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广。

有机溶剂沉淀的特点分辨率高；溶剂容易分离，并可回收使用；产品洁净；容易使蛋白质等生物大分子失活；应注意在低温下操作；成本高溶剂选择介电常数要小致变性作用要小（甲醇）毒性要小、挥发性适中水溶性要好影响有机溶剂沉淀的主要因素温度：低温有利于防止溶质变性；有利于提高收率（溶解度下降）；搅拌速度：散热溶液pH值：原则是避免目标蛋白与杂质带有相反的电荷，防止共沉现象。离子强度：