404-ZL泰乐菌素发酵液检验操作规程

泰乐菌素发酵液检验操作规程编 号：SOP-ZL-404第1页共5页版本号：00制订人/日期年月曰发放日期年月曰审核人/日期年月曰实施日期年月曰批准人/日期年月曰颁发部门质量科QA分发部门质量科QC1目的：规定泰乐菌素发酵液及放罐发酵液的检验操作方法，确保公司产品质量。2范围：适用于QC室检验人员对泰乐菌素发酵液的检验。3职责：QC室检验人员对本规程的实施负责。4内容：4.1化学效价的测定4.1.1原理在0.1mol/L的盐酸溶液中，泰乐菌素在290nm波长处有最大吸收，可用紫外分光光度法进行检测。4.1.2试剂4.121O.lmol/L盐酸：取浓盐酸9ml,加纯化水定容至1000m1,摇匀。标准曲线制备4.1.3.1取约25mg泰乐菌素标准品于50ml容量瓶中，精密称定，用纯化水溶解、定容、摇匀，配成含量约为500u/m1的标准溶液，分别精密量取上述标准溶液0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml于25ml容量瓶中，用0.1mol/L盐酸标准溶液定容摇匀。设定光度计检测波长为290nm，使用1cm石英比色皿，以0.1mol/L盐酸标准溶液作为空白溶液调节仪器零点，测量溶液吸光度，以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标，绘制标准曲线，计算标准曲线方程。要求：相关系数r三0.999。4.1.3.2更换测定用仪器或仪器大修后需重新制备标准曲线。测定方法4.1.4.1样品预处理：a取样品约30ml，用粉末状分析纯硫酸铝调节pH值至2.5〜3.0，滤纸过滤或用离心法泰乐菌素发酵液检验操作规程编号：SOP-ZL-404第2页共5页版本号：00得到发酵液清液。b稀释根据样品的估计效价，用纯化水稀释，稀释后溶液估计效价在300~700u/ml范围内。具体稀释倍数见下表。样品名称稀释倍数稀释过程发酵液5精密量取1.0ml发酵液清液，加入4.0ml纯化水10精密量取1.0ml发酵液清液，加入9.0ml纯化水15精密量取1.0ml发酵液清液，加入14.0ml纯化水20精密量取1.0ml发酵液清液，加入19.0ml纯化水25精密量取1.0ml发酵液清液，加入24.0ml纯化水放罐20精密量取1.0ml发酵液清液，加入19.0ml纯化水4.1.4.2吸光度的测定精密量取样品稀释液0.5ml,加入0.1mol/L盐酸标准溶液12ml。设定光度计测量波长为290nm,使用1cm石英比色皿，以0.1mol/L盐酸标准溶液作为空白溶液调节仪器零点,测量溶液吸光度。4.1.5计算化学效价(u/ml)=(kXA+b)XN式中 k：标准曲线所得的直线斜率；A：所测样品的吸光度；b：标准曲线所得直线截距；N：稀释倍数。4.2HPLC法测发酵液组分4.2.1HPLC条件色谱柱：C184.6mmX250mm,5m检测波长：290nm泰乐菌素发酵液检验操作规程编号：SOP-ZL-404第3页共5页版本号：00进样体积：20l柱温：室温流动相：200g/l高氯酸钠溶液：乙腈=60：40(pH值2.5±0.1)流速：1.0ml/min运行时间：35分钟记录图谱时间：1.5倍泰乐菌素A峰保留时间相对于泰乐菌素A的保留时间：泰乐菌素C~0.5A,泰乐菌素B~0.7A,泰乐菌素D~0.8A，泰乐菌素A峰的保留时间在11.0〜14.0分钟之间。试剂与溶液的配制4.2.2.1流动相[200g/l高氯酸钠溶液：乙腈=60：40(pH值2.5±0.1)]称取360g高氯酸钠于2000ml烧杯中，加入纯化水，搅拌使溶解，稀释至1800ml,用1mol/L盐酸溶液调节pH值至2.5±0.1，用0.45pm的微孔滤膜过滤，倒入5000ml试剂瓶中，加入1200ml用0.45pm的微孔滤膜过滤后的色谱纯乙腈，混合均匀备用。用时倒入1000ml试剂瓶中超声15分钟。注意：乙腈有毒，易挥发，操作时在通风橱内操作，佩带防护手套，若不慎沾到皮肤上，立刻用清水清洗。50%乙腈溶液:量取用0.45pm的F型微孔滤膜过滤后的乙腈和纯化水各500ml于1000ml试剂瓶中，摇匀。4.2231mol/l的盐酸溶液：量取浓盐酸10ml,加纯化水至120ml。磷酸泰乐菌素标准溶液：取约10毫克磷酸泰乐菌素标准品置于50毫升的容量瓶中，精密称定，用50%的乙腈溶液溶解、定容、摇匀，转至棕色瓶中，冷藏保存于冰箱内。此标准溶液用于确定泰乐菌素C峰和A峰的保留时间。泰乐菌素标准溶液：取约25毫克泰乐菌素标准品置于50毫升的容量瓶中，精密称定，用50%的乙腈溶液溶解、定容、摇匀，转至棕色瓶中，冷藏保存于冰箱中。4.2.3系统适应性试验泰乐菌素发酵液检验操作规程编号：SOP-ZL-404第4页共5页版本号：00在分析样品之前，先做系统适应性试验，合格后方可进行样品检测。精密量取20pl泰乐菌素标准溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，泰乐菌素标准溶液进5针，确认系统适应性试验合格。泰乐菌素A峰的峰面积相对标准偏差不大于2.0%,理论板数不低于2000,泰乐菌素A峰与D峰分离度大于1.5,拖尾因子小于1.5。样品溶液的制备取样品约30ml,用硫酸铝调节pH值为2.5〜3.0,滤纸过滤，精密量取续滤液1.00ml于一比色管中，加入19.00ml纯化水，摇匀后用0.45pm的微孔滤膜过滤。测定精密量取续滤液20pl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。计算Ai泰乐菌素A%= x100%工AAi泰乐菌素B%= x100%工AAi泰乐菌素C%= x100%乙AAi泰乐菌素D%= x100%乙A式中Ai：被测含量组分峰面积；刀A：参与计算的全部峰面积之和。5相关文件及记录泰乐菌素发酵液理化检验记录见附页1泰乐菌素发酵液HPLC法检验记录见附页2泰乐菌素标准曲线制备记录见附页3泰乐菌素发酵液HPLC法检验报告单见附页4发酵罐生产检验批报记录见附页5

泰乐菌素发酵液检验操作规程编号：SOP-ZL-404第5页共5页版本号：006文件变更历史版本号变更日期变更描述变更人

记录编号：R-SOP-ZL-404A泰乐菌素发酵液理化检验记录批号：周期： h检验日期： 年月日时分室内温度： °C检验仪器：离心机编号： 电热恒温水浴锅编号：紫外-可见分光光度计编号： 泰乐菌素标准曲线编号：检验过程：1化学效价1.1样品预处理取样品约30ml,用粉末状分析纯硫酸铝调节pH值为2.5〜3.0,滤纸过滤或用离心法得到发酵液清液。1.2样品稀释精密量取1.0ml发酵液清液，加入 ml纯化水，即得样品稀释液。1.3吸光度测定精密量取样品稀释液0.5ml,加入0.1mol/L盐酸标准溶液12ml。设定光度计测量波长为290nm,使用1cm石英比色皿，以0.1mol/L盐酸标准溶液作为空白溶液调节仪器零点，测量溶液吸光度 。1.4计算化学效价（u/ml）=检验人： 复核人：备注：记录编号：R-SOP-ZL-404B泰乐菌素发酵液HPLC检验记录批号：检验日期年月日周期：流动相编号：1检验仪器仪器编号：色谱柱编号：2色谱条件检测波长： nm流动相配比：流动相流速： ml/min运行时间：min进样量： gl3样品溶液制备取样品约30ml,用硫酸铝调节pH值为2.5〜3.0,滤纸过滤，精密量取续滤液1.00ml于一比色管中，加入19.00ml纯化水，摇匀后用0.45um的微孔滤膜过滤。4系统适用性：取对照品溶液连续进样5针，其峰面积分别为A1 、A2 、A3 、A4 、A5 对照品溶液峰面积RSD为 ;泰乐菌素A拖尾因子为 。5数据处理泰乐菌素发酵液组分（％）泰乐菌素A（%）泰乐菌素B（%）泰乐菌素C（%）泰乐菌素D（%）泰乐菌素总组分（％）供试品备注:附页3文件编号：SOP-ZL-404 版本号：00记录编号：R-SOP-ZL-404C泰乐菌素标准曲线制备记录标准曲线名称：标准曲线编号：标准品编号：曲线制备时间： 年月日仪器:紫外-可见分光光度计编号:标准曲线制备过程：1标准溶液制备精密称取泰乐菌素标准品 mg于50ml容量瓶中，用纯化水溶解、定容，即得含量为 的泰乐菌素标准溶液。2梯度稀释：用吸量管分别吸取上述标准溶液，按下表方式进行梯度稀释：编号标准溶液的体积(ml)一25ml浓度(mg/25ml)10.620.831.041.251.461.63标准曲线计算：按下表整理数据，以吸光度为横坐标，以浓度为纵坐标，计算回归方程。编号123456C(u/25ml)A(吸光度)泰乐菌素标准曲线公式为:r=批准人:曲线启用时间:批准人:备注:记录编号：R-SOP-ZL-404D泰乐菌素发酵液HPLC检验报告单批号： 周期： h 报告单编号：送检日期： 年 月 日报告日期： 年 月 日检验项目检验结果HPLC法泰乐菌素A（%）泰乐菌素B（%）泰乐菌素C（%）泰乐菌素D（%）报告人：复核人：备注：文件编号：SOP-ZL-404版本号：00记录编号：R-SOP-ZL-404D泰乐菌素发酵液HPLC检验报告单批号： 周期（放罐）： h 报告单编号：送检日期： 年 月 日报告日期： 年 月