甘薯茎尖组织培养研究

甘薯茎尖组织培养研究

重庆是中国的主要甘薯产区之一。它的种植面积和产量分别为中国的三倍和四级。甘薯已成为当地农业的主要产业。甘薯由于受病毒侵染导致种性退化,使优良品种的育种特性无法得到全部展现,直接影响到单产和品质,严重阻碍了良种推广和大面积生产。目前,采用茎尖脱毒是恢复品种育种特性,防止或减少因病毒感染造成损失的最有效途径。本文通过对当前重庆市主推的高淀粉专用品种‘渝薯2号’进行茎尖脱毒培养效果的研究,进一步探讨高淀粉品种茎尖组织培养的方法,以期能够提高品种脱毒率和成苗率。1材料和方法1.1材料表面试验选用高淀粉品种‘渝薯2号’作为供试材料。1.2方法1.2.1不同方法消毒微茎尖培养大田选取生长势强的健康植株,剪取3cm左右长的顶芽,将其用0.1%洗衣粉液浸泡10min,流水冲洗1~2h后,采用不同方法消毒:(1)用2.5%NaOCl水溶液或0.1%生汞一次浸泡消毒;(2)先用75%酒精浸泡60s,再用2.5%NaOCl或0.1%升汞消毒5~10min。之后用无菌水冲洗5次,切取合适的微茎尖,置于添加筛选的培养基上培养。5d后统计污染数;培养70d,统计死亡数、成苗数。计算污染率、死亡率、成苗率,筛选最佳消毒方法。1.2.2因素4个不同的处理使用正交设计的方法筛选最优不同浓度生长调节剂配比。取3个因素:BA、NAA、GA3,每个因素设3个水平(BA0.5、1.0、2.0mg/L,NAA0.05、0.1、0.2mg/L,GA30.05、0.50、1.00mg/L),共9个处理。培养70d观察成苗率及芽的生长表现。1.2.3叶原基、茎尖在培养方基中的筛选取渝薯2号带病毒植株的芽,消毒后剥离带1个叶原基(0.1~0.2mm)、带2个叶原基(0.3~0.4mm)、带3个叶原基(0.6~0.7mm)的茎尖接种于筛选的培养基上培养70d,统计脱毒率、成苗率、单茎尖芽数。1.2.4培养二次培养基采用一次培养及二次培养2种培养方式。一次培养即始终在筛选的生长调节剂培养基上培养;二次培养即在生长调节剂培养基上培养30d左右,待茎尖分生组织膨大变绿后,转到1/2MS无生长调节剂的固体培养基上培养。培养70d后统计成苗率、单茎尖芽数、平均株高。1.2.5添加蔗糖、琼脂粉培养基配制:不同培养基按试验要求添加生长调节剂或其他成分;每升MS培养基中加入30g蔗糖、8g琼脂粉,pH=5.8。培养条件:T=(28±2)℃;光照时间16h/d;光照强度2000~3000lx。2结果与分析2.1不同方法使用一步法,污染率高,死亡率低,成苗率高。c组不同消毒方法条件下,茎尖的污染率、死亡率和成苗率有明显的差异。A组使用两步法,污染率最低,但死亡率却显著上升;B组使用一步法,污染率较低,死亡率最低,成苗率超过76%;C组也使用一步法,但污染率最高,说明NaOCl的消毒效果次于升汞。试验结果表明,处理5(0.1%升汞的溶液消毒7~8min)的污染率、死亡率低,成苗率达到85%(见表1)。2.2渝薯2号茎尖分生组织的培养顺序根据正交设计法,某因子不同水平的极差越大,说明该因子对试验指标的影响越大。从正交试验的结果(表2)可以看出,3个因子对渝薯2号茎尖分生组织培养的影响顺序由大到小为NAA>GA3>BA。根据某因素kj值大小确定该因子的最好水平,可知BA最好水平为1.0mg/L、NAA最好水平为0.05mg/L、GA3最好水平为0.5mg/L。2.3再生植株的培养在筛选的培养基上,由不同大小茎尖诱导的愈伤组织,其生长速度、成苗率和脱毒率有明显差异。从表3可以看出,带1个、2个、3个叶原基的茎尖的成苗率分别为55.3%、75.8%、81.5%,可见随着外植体所带叶原基数目的增多,培养出再生植株就越容易。在培养过程中,带1个叶原基的茎尖表现出愈伤组织形成慢、根和叶分化慢、单茎尖芽数少(1.2个),比带2个、3个叶原基的茎尖少0.6和0.9个。带3个叶原基的茎尖成苗率较高,但脱毒率显著下降,只有35.5%,显然,茎尖越大,脱毒效果越差。试验结果表明,大小0.3~0.4mm、带2个叶原基的茎尖,在成苗率、脱毒率和单茎尖芽数3个方面综合表现最好。2.4次培养与自然株高、成苗率、单茎尖芽数的变化不同的培养方式对茎尖分生组织培养的影响有差异。采用一次培养平均株高与二次培养相比差异不大,但成苗率高15.7个百分点,单茎尖芽数增加0.2个(表4)。在茎尖分生组织培养中,成苗率是关键因素,因此使用一次培养比二次培养效果更好。3讨论3.1外植体消毒时间正确选择消毒剂及浓度,严格把握消毒时间是取得良好消毒效果的关键。升汞可使蛋白质变性,对细菌的杀死能力很强,在组织培养中,细菌比真菌去除难度大,用升汞进行外植体消毒效果更好。污染率与消毒时间成反比,死亡率与消毒时间成正比,过高的污染率和死亡率均会使消毒环节成为无用功,确定消毒时间要综合考虑这2个因素。二步法消毒过程中,酒精主要消杀外植体表面和增加外植体表面透性,使第2种消毒剂更易于进入外植体组织内部杀菌。甘薯是草本植物,表皮柔嫩,酒精的使用使升汞进入外植体内部的剂量过多,导致死亡率大幅上升。3.2实行切取茎尖小组景外植体质量、茎尖大小和病毒种类是茎尖脱毒效果的主要影响因子。茎尖越小,去除病毒的可能性越大,但培养难度也越大。实际操作中,如果切取茎尖太小,不带、少带或带叶原基不完整,成活率很低,就失去了实际应用的价值。为了保证成苗和脱毒,可结合田间株选,选取长势强、没有病害症状的薯苗,结合热处理,剥取0.3~0.4mm、带2个叶原基的茎尖,成苗后再对植株反复切取0.4mm以下的茎尖培养,能有效去除病毒。3.3叶原基的生长茎尖越大,成活率越高,但病毒越难去除。叶原基是茎尖成活的必要条件,只带1个叶原基的茎尖成苗较难,一般带2个叶原基,绝大多数品种能够培养出再生植株。有些报道中主张以茎尖的绝对长度作为茎尖适宜长度的标准,但不同基因型、不同栽培条件、不同部位的茎尖生长点大小差异较大,因此,这样的标准是不准确的。3.4基因型茎尖的生长植物生长调节剂的种类、配比和浓度对茎尖分化成苗具有重要作用,尤以生长素最为突出。一般来说,少量的细胞分裂素类物质有利于茎尖的成活,常用的有6-BA,浓度为0.5~1.0mg/L;生长素中常用的有IAA和NAA,浓度范围为0.1~1.0mg/L。唐君等(2001)认为不同基因型茎尖对培养基有较强的选择性李强(2001)认为在一定范围内,BA有促进愈伤组织发生和芽分化的作用;对于不易诱导材料,BA适宜浓度为4.0mg/L;对于易诱导材料,BA浓度以2.0mg/L为宜;龚一富、高峰(1999)则认为0.5mg/LBA是愈伤组织生长最适培养基。本试验结果表明,“MS+1.0mg/LBA+0