植物dna去甲基化酶基因的克隆与功能分析

植物dna去甲基化酶基因的克隆与功能分析

二甲基硝基化是一种重要的表观遗传特征，包括组织机械的压碎、重组印花、x染色体的失去等生物学过程。DNA甲基化能够调节植物的早期发育、基因座专一性基因表达。在高等植物中,有CG、CHG和CHH(H代表A、C或T)3种甲基化位点,其中CG和CHG位点的甲基化是直接调节基因表达最主要的甲基化形式。DNA的甲基化水平和模式取决于DNA甲基转移酶和去甲基化酶。植物中的甲基转移酶主要有甲基转移酶1(MET1)、结构域重排甲基转移酶(DRM)和染色质甲基化酶(CMT)3类,对应动物中的DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。MET1能维持重复和单拷贝DNA序列中CG类型的甲基化,并影响形态特征、花期调控和移植变化;DRM包括DRM1、DRM2和Zmet3,对非对称位点的DNA序列进行从头甲基化,维持失活转座子及转基因沉默位点的胞嘧啶甲基化,同时也能对与siRNA同源的序列中的胞嘧啶进行从头甲基化;CMT主要维持CHG和CHH核苷酸序列中胞嘧啶的甲基化,同时也能对与siRNA同源的序列的胞嘧啶进行从头甲基化;此外,还有通过MET1维持CG甲基化的HDA6、通过CMT3维持非CG甲基化的SUV家族、从头进行DNA甲基化的NRPD1b等其他甲基化酶。研究表明,MET1、DRM和CMT基因突变后可以引起拟南芥(Arabidopsisthaliana)整个基因组或部分基因DNA甲基化水平发生改变[15~17]。DNA去甲基化酶基因中含有最保守的DNA糖苷酶结构域。在植物中,DNA糖苷酶结构域是一种双功能团:一方面直接剪切甲基胞苷,另一方面能在脱碱基位点裂开DNA主链;然后通过DNA碱基的切除修复途径(DNA聚合酶和连接酶)用无修饰的胞苷填补碱基空位。DNA糖苷酶有两种:一种只是水解碱基和脱氧核糖之间的糖苷键,另一种不仅水解碱基和脱氧核糖之间的糖苷键,并且具有脱嘌呤嘧啶内切核酸酶的作用,裂解DNA主链的无碱基位点。DNA去甲基化酶基因主要有4个家族:DME、ROS1、DML2和DML3。只存在于双子叶植物中的DME,通常在雌配子体的中央细胞和助细胞中优先表达,从而影响胚和胚乳的发育,而ROS1在植物的所有组织中都有表达,它能抑制基因启动子的甲基化。如水稻(Oryzasativa)中的ROS1b(DNG701)基因的表达能够调节逆转录转座子Tos17的甲基化水平,进而改变其转座活性。DML2和DML3主要是抑制植物营养组织中特定位点的DNA甲基化。对DNA糖苷酶的结构域序列进行分析显示,ROS1是双功能团的DNA糖苷裂解酶,而DME为单功能团糖苷酶,但有研究也表明DME、DML2、DML3和ROS1一样是双功能团的DNA糖苷裂解酶[26~28]。在植物生长发育和环境应答过程中,DNA去甲基化能够激活一些特殊基因的功能以及对基因组后生状态进行重置,分为被动去甲基化和主动去甲基化。在DNA复制时,DNA甲基转移酶的失活会导致DNA被动去甲基化;而与DNA复制无关的DNA主动去甲基化则需要DNA去甲基化酶参与,并且在DNA主动去甲基化中占主导地位。DNA主动去甲基化可以阻止内外源基因的转录沉默,调节印迹基因和转座子的转录。ROS1介导的DNA主动去甲基化可引起5SrDNA染色质的解凝,以及引起植物对生物胁迫和环境胁迫的响应[34~36];另外,还可以阻止RNA介导的DNA甲基化。DRM2通过siRNA的装载可以对整个序列上的胞嘧啶(CG、CHG和CHH)进行甲基化,从而促使含有同源DNA序列的基因转录沉默[37~40]。已有的研究表明,当基因的启动子能够生成24nt的siRNA时,该基因就能被RNA介导的DNA甲基化所沉默。DNA去甲基化酶在DNA主动去甲基化中起到重要作用。迄今为止,植物DNA去甲基化酶基因的功能研究主要集中在水稻和拟南芥中,然而对于其在不同物种中的进化与线性同源关系还不太清楚,这在一定程度上限制了对该基因家族的有效利用。本文选取已知的10个DNA去甲基化酶基因为参照,通过序列比对从水稻、高粱(Sorghumbicolor)、拟南芥、毛果杨(Populustrichocarpa)基因组中分别获得8、6、7、6个同源基因,绝大部分基因在染色体上的位置是线性同源的;同时基于糖苷酶保守区域的氨基酸序列构建系统进化树,探究DNA去甲基化酶基因在高等植物中的进化关系;水稻和拟南芥中的基因表达分析表明,基因的组织特异性表达与进化密切相关。该研究有助于进一步研究DNA的主动去甲基化以及DNA去甲基化酶基因表观调控的有效利用。1材料和方法1.1dna去甲基化酶基因双子叶植物拟南芥中有4个DNA去甲基化酶基因:ROS1、DME、DML2和DML3;而单子叶植物水稻中有6个DNA去甲基化酶基因:ROS1a、ROS1b、ROS1c、ROS1d、DML3a和DML3b。以水稻、拟南芥中的这10条基因的氨基酸序列为参考,以E<e-51.2糖苷酶保守区域氨基酸序列的获取以DNA去甲基化酶基因中最保守的糖苷酶结构域为对象,利用WebLogo3软件(/create.cgi)获得糖苷酶保守区域氨基酸序列的Logo图。同时使用ClustalX软件进行多序列联配,并用MEGA5.05构建系统进化树,构建方法选用最大似然法,采用最佳的WAG模型,Bootstrap值设为1000。1.3全民主义基因同源片段的获得以所有鉴定出的DNA去甲基化酶基因为参照,分别选取其上、下游的基因,在水稻、高粱、拟南芥、毛果杨基因组中寻找同源基因,获得对应的染色体同源区段。1.4水稻和拟南甲基化酶的发现,用微阵列分析工具MeV软件(MultiExperimentViewer)得到基因表达的热图(heat-map)。2结果与分析2.1dna去甲基化酶基因本研究以拟南芥和水稻中已知的10个DNA去甲基化酶基因的氨基酸序列为参照,在水稻、高粱、拟南芥和毛果杨中分别找到8、6、7、6个DNA去甲基化酶同源基因(表1)。在水稻中新鉴定出2个基因Os06g13070和Os11g16580;在拟南芥中新鉴定出3个基因AT1G05900、AT2G31450和AT3G47830。DNA去甲基化酶基因的数目在4个物种中相差不大(仅0~2个),表明控制植物DNA主动去甲基化的基因数目相仿。然而DNA去甲基化酶基因的氨基酸残基长度却有显著差异,短序列变幅在277~386个氨基酸,长序列为901~1987氨基酸。在水稻、高粱、拟南芥和毛果杨4个物种中DNA去甲基化酶基因以长序列居多,但其短和长的比例并不相同,分别为3:5、1:5、2:5和2:4。DNA去甲基化酶基因多数分布在不同的染色体上,具有随机性。如拟南芥中的5对染色体上均有DNA去甲基化酶分布,水稻中DNA去甲基化酶多数位于较长染色体(1、2、4、5、6)上,高粱中则多数分布于较短染色体(6、8、9、10)上,而毛果杨中多分布在19对染色体的中等长度染色体(6、7、8、10)上。DNA去甲基化酶基因在染色体上的分布见表1。2.2高等植物中dna去甲基化酶基因的进化氨基酸序列是酶的一级结构,相对于碱基序列更能反映不同DNA去甲基化酶基因间的关系。鉴于DNA去甲基化酶基因全长序列在不同物种或同一物种不同家族中差异较大,不适合做进化分析。因此,本研究选择其最保守的糖苷酶结构域149个氨基酸加以分析(图1)。结果表明,该结构域由8个螺旋区(1-9、15-20、28-33、39-50、59-68、84-95、119-130、138-149)组成,而且发现有6个氨基酸非常保守,它们是赖氨酸(K,40位)、天冬氨酸(D,59位)和半胱氨酸(C,133位、140位、143位、149位)(图1)。为揭示高等植物中DNA去甲基化酶基因的进化关系,本研究采用最大似然法构建DNA去甲基化酶基因的分子系统进化树。所有的基因分为4个亚家族:ROS1,DML3,DML4和DML5,其中ROS1和DML3亚家族中含有已知的10个基因,而DML4和DML5亚家族中是新鉴定的基因(图2A)。本文发现在ROS1亚家族中,单子叶植物的ROS1基因都聚集在一起,而双子叶植物的ROS1则和DME基因聚集在一起。对该组基因全长氨基酸序列分析发现双子叶植物中的DME与ROS1基因的同源性高于与单子叶植物ROS1基因的同源性(图2B),推测双子叶植物的DME基因是从ROS1基因复制过来的,并且与单子叶植物的ROS1基因属同源基因。在单、双子叶植物分化之后,单子叶植物内部ROS1基因还继续复制产生新的ROS1基因,甚至水稻和高粱从共同祖先分化之后,水稻中的ROS1基因仍在复制(ROS1a和ROS1b)。在DML3亚家族中所有的DML3基因聚在一起,通过全长序列分析进一步证实了该结果(图3C),但拟南芥的DML2与ROS1同源性高于与DML3基因之间的同源性,推测DML2与ROS可能是同源基因。而在新鉴定的DML4和DML5亚家族中4个物种都有相应的同源基因(图3A),表明此两类亚家族基因很保守,为此,根据序列的同源性分别将其命名为DML4和DML5(表1)。2.3醇溶蛋白基因与dna的同源关系为了验证在系统进化分析中结果的可靠性,本研究对所有的DNA去甲基化酶基因在基因组位置上的共线性进行分析。水稻中的Os05g37350(ROS1b和Os05g37410(ROS1c)是串联复制基因,这两个基因和高粱的Sb09g021920(ROS1b)是线性同源基因;水稻Os02g29230(ROS1d)与高粱的Sb04g019820(ROS1d)是同源基因;然而在高粱中却找不到Os01g11900(ROS1a)的线性同源基因,推测该基因可能被缺失或者在水稻中获得新复制的Os01g11900(ROS1a)基因;同时高粱中多了Sb08g008620(ROS1e),从系统进化分析结果可以推断该基因可能是从Sb04g019820(ROS1d)基因复制得到的(图2,图3A)。本研究发现,在双子叶植物中,拟南芥的DME基因(At5G04560)与毛果杨的DME基因(DMEa,Potri.008G025900和DMEb,Potri.010G234400)是线性同源基因(图3A);而拟南芥的At3G10010(DML2)基因与At2G36490(ROS1)和Potri.006G116000(ROS1)线性同源(图3A),暗示毛果杨的DMEa和DMEb以及拟南芥的DML2与ROS1是由染色体复制或者是全基因组复制所产生的,随后经过长期复杂的进化,At3G1001(DML2)和At2G36490(ROS1)在结构和功能上会发生变化。进一步分析发现DME与ROS1以及DML2位点之间存在同源关系,表明拟南芥和毛果杨分化之前发生过一次全基因组复制,这与之前的研究结果相一致。在DML3亚家族中5个DML3同源基因Os02g29380(DML3a)、Os04g28860(DML3b)、AT4G34060(DML3)、Potri.001G150000(DML3)和Sb06g029335(DML3)之间不存在线性同源关系(图3B),推测这是因为DNA去甲基化酶DML3基因家族在进化过程中经历多次基因复制和丢失事件,在叶绿体基因组进化过程中发生过类似情况。在禾本科醇溶蛋白基因家族进化过程中,不同亚科物种间的醇溶蛋白基因不存在线性同源关系,是独立进行遗传。DNA去甲基化酶基因DML3亚家族不但在单、双子叶植物物种间存在独立遗传,而且在单子叶植物内部不同亚科间也是独立遗传。但是,在DML4和DML5亚家族中新鉴定的DNA去甲基化酶基因却有着非常保守的线性同源关系(图3:C,D)。2.4dna去甲基化酶基因表达为进一步理解DNA去甲基化酶基因的表达模式和水平,本研究对水稻的RNA高通量测序结果和拟南芥的芯片结果进行了分析。在水稻的不同发育阶段,11种组织中DNA去甲基化酶基因的表达量差异明显,Os02g29380(DML3a)、Os11g16580(DML5)和Os01g11900(Ros1a)的表达量都较高,而Os01g28860(DML3b)、Os02g29230(Ros1d)都较低(图4A)。大多数DNA去甲基化酶基因在雌蕊、花序和胚中的表达要明显高于其他组织,只有2个基因DML3b和Ros1d的表达量较低。可见DNA去甲基化酶基因的表达具有组织特异性。另外,与其他组织相比,DNA去甲基化酶基因在水稻胚乳中的表达量较低,这与胚乳的DNA甲基化水平低于其他组织相吻合,推测胚乳中的DNA去甲基化酶基因主要参与DNA的被动去甲基化。DNA去甲基化酶基因还具有时空表达的特异性。在拟南芥12个不同组织中的表达显示,多数基因的表达量在营养生长期随着播种天数增加而升高(图4B),进入生殖生长期后,在雄蕊和衰老叶片中表达量下降(图4:C,D)。然而,At5G04560(DME)和At1G05900(DML5b)在所有组织中的表达均相对较低。3dna去甲基化酶基因DNA去甲基化酶基因普遍存在于植物基因组中,本研究结果显示在单子叶、双子叶植物分化之前至少存在4个DNA去甲基化酶(类似)基因(Ros1、DML3、DML4和DML5),其中新鉴定的2个基因(DML4和DML5)在单、双子叶植物中非常保守(图2A,图3:C,D),表达量也较高(图4:A,B),表明它们具有重要的潜在功能,有待进一步实验验证。在物种的进化过程中,DNA去甲基化酶基因家族存在着串联复制、局部复制和全基因组复制等3种复制形式(图3)。同时在ROS和DML3组中发生过基因丢失,特别是DML3,然而与禾本科中的醇溶蛋白基因家族类似,在该基因丢失之前复制了同源基因(图3B)。拟南芥ROS家族中的Ros1、DML2和DME基因是全基因组复制所产生的同源基因,然而由于基因突变使得3个基因的功能都发生了变化,这是由于物种进化过程中产生基因无功能化、新功能化和亚功能化所致,也说明DNA去甲基化酶基因在进化过程中会更加倾向趋异进化。不同的DNA甲基化酶基因通常会有不同的甲基化模式,DRM2调节CHH位点的甲基化,MET1调节CG位点的甲基化,CMT3调节CHG位点的甲基化,然而DNA去甲基化酶基因却没有这种作用模式,一些ROS1偏好CHG位点,而另一些对胸腺嘧啶前的CG也有偏好性。DME基因从DNA上移除甲基胞苷,然后通过一个相关蛋白去甲基化,是基因组印记所必需的;Ros1通过去除基因启动子区域的甲基化阻遏输入基因和同源基因的