药物含量测定技术-仪器分析(药品质量检测技术课件)

任务二：仪器分析法高效液相色谱法高效液相色谱法

1.概述HPLC(highPerformanceLiquidChromatograohy)—高效液相色谱是一种区别于经典液相色谱，基于仪器方法的高效能分离手段：高性能色谱柱，高精度输液泵，高灵敏度检测器……广泛应用于各个领域：医药、环保、石化、生命科学、食品工业、农业等无论在技术上、理论上，还是在应用上仍处于发展阶段。高效液相色谱法

1.概述

HPLC的仪器配置及流程高效液相色谱法

2.原理

高效液相色谱法

2.原理

色谱图：色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保留时间。高效液相色谱法

3.理论基础A为涡流扩散项B/u分子扩散项Cu项即传质阻力项高效液相色谱法4.HPLC特点高压、高速、高效、高灵敏度、样品回收方便。

经典LCHPLC柱之内径1~5cm~0.4cm长度50~100cm15~50cm填充材料粒度150µm~200µm4µm~10µm使用压力1~10atm50~200atm分离时间0.5h~天~10min高效液相色谱法4.HPLC特点与气相色谱法比较，HPLC的优点1.分析对象广

气相色谱只限于分析气体和沸点较低的化合物；HPLC不受样品挥发性和热稳定性的限制，适用于高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质。原则上讲，几乎可以分析除永久气体外所有的有机和无机化合物。

高效液相色谱法⒉流动相对分离起作用

气相色谱的流动相仅起运载作用，对组分不产生相互作用力；HPLC的流动相对组分产生相互作用力，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数。⒊经常在室温条件下操作

气相色谱法一般在较高温度下进行。缺点：仪器设备费用昂贵，操作严格。任务二：仪器分析法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱仪的应用1.定性分析方法HPLC的定性分析方法可以分为色谱鉴定法和非色谱鉴定法。非色谱鉴定法又可以分为化学鉴定法和两谱联用鉴定法。2.定量分析方法HPLC的定量分析方法，有内标法、外标法、加校正因子的主成分自身对照法、不加校正因子的主成分自身对照法以及峰面积归一化法等，常用内标法和外标法进行定量分析。高效液相色谱法

1.定性分析法

①色谱鉴定法：色谱鉴定法是利用色谱定性参数保留时间（或保留体积）和相对保留值或用对照法对组分进行鉴别分析。原理是同一物质在相同色谱条件下保留时间相同，此法只对范围已知的化合物进行定性分析。②非色谱鉴定法a化学鉴定法化学鉴定法是利用专属性化学反应对分离后收集的组分进行定性分析。此法只能鉴别组分属于某一类化合物。通常是收集色谱部分，再与官能团分类试剂反应。b两谱联用鉴定法当相邻组分的分离度足够大时，以制备HPLC获得纯组分，而后用紫外光谱、红外光谱、质谱和核磁共振波谱等分析手段进行定性鉴定。高效液相色谱法

2.定量分析方法

①内标法测定供试品中主成分或某个杂质含量：以待测组分和内标物的峰高比或峰面积比求算试样含量的方法。使用内标法可以抵消仪器稳定性差、进样量不够准确等原因带来的定量分析误差，如果在试样预处理前加入内标物，则可以抵消方法全过程引起的误差。内标法可分为校正曲线法、内标一点法、内标二点法及校正因子法等。高效液相色谱法

2.定量分析方法

②外标法测定供试品中主成分含量：以对照品的量对比求算试样含量的方法。对照品在与被测样品相同的色谱条件下单独测定，把得到的色谱峰面积与被测组分的色谱峰面积进行比较求得被测组分的含量。外标物与被测组分同为一种物质但要求具有一定的纯度，分析时外标物的浓度应与被测物浓度相接近，以利于定量分析的准确性。外标法在操作和计算上可分为校正曲线法和校正因子求算。校正曲线法是用已知不同含量的标样系列等量进样分析，然后做出响应信号与含量之间的关系曲线，也就是校正曲线。定量分析样品时，在测校正曲线相同条件下进同等样量的等测样品，从色谱图上测出峰高或峰面积，再从校正曲线查出样品的含量。校正因子求算法时根据标样多次分析后得到的响应信号与其含量，求出它的绝对校正因子，再根据公式求出待测样品中的含量。高效液相色谱法

2.定量分析方法

③加校正因子的主成分自身对照法：测定杂质含量时，可采用加校正因子的主成分自身对照法。在建立方法时，按各品种项下的规定，精密称取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制测定杂质校正因子的溶液，进样，记录色谱图，按下式计算杂质的校正因子。校正因子（ƒ）=AsCr/Ar×Cs

式中As——杂质对照品的峰面积或峰高

Cr——待测成分对照品的浓度Ar——待测成分对照品的峰面积或峰高ƒ——杂质对照品待测成分的浓度高效液相色谱法

2.定量分析方法

④不加校正因子的主成分自身对照法：测定杂质含量时，若没有杂质对照品时，也可以采用不加校正因子的主成分自身对照法。同上述加校正因子的主成分自身对照法配制对照溶液并调节检测灵敏度后，取供试品溶液和对照溶液适量，分别进样。除另有规定外，前者的记录时间，应为主成分色谱峰保留时间的2倍。测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积，并与对照溶液主成分的峰面积比较，计算杂质含量。高效液相色谱法

2.定量分析方法

⑤峰面积归一化法：按各品种项下的规定，配制供试品溶液，取一定量注入仪器，记录色谱图。测量各峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积占总峰面积的百分率。用于杂质检查时，由于峰面积归一化法测定误差大，因此，通常只用于粗略考察供试品中的杂质含量。除另有规定外，一般不宜用于微量杂质的检查。任务二：仪器分析法气相色谱法气相色谱法气相色谱仪的测定方法

测定方法包括内标法、外标法、峰面积归一化法以及标准溶液加入法等。其中前三种测定法的具体内容均同高效液相色谱法[«中国药典»(2010版)附录VD]项下相应的规定,在此只介绍标准溶液加入法。气相色谱法气相色谱仪的测定方法

标准溶液加入法：精密称取某个杂质或等测成分对照品适量，配制成适当浓度的对照品溶液，取一定量，精密加入供试品溶液中，根据外标法或内标法测定杂质或主成分含量，再扣除加入的对照品溶液含量，即得供试品溶液中某个杂质的主成分含量。气相色谱法气相色谱仪的测定方法

也可按式进行计算，加入对照品溶液前后校正因子应相同，即：

待测组分的浓度Cx可通过下式进行计算：

式中Cx—供试品中组分X的浓度Ax—供试品中组分X的色谱峰面积ΔCx—所加入的已知浓度的待测组分对照品的浓度Ais—加入对照品后组分X的色谱峰面积气相色谱法气相色谱仪的测定方法

由于气相色谱法的进样量一般仅数微升，为减小进样误差，尤其当采用手工进样时，由于留针时间和室温等对进样量也有影响，故以采用内标法定量为宜；当采用自动进样器时，由于进样重复性的提高，在保证分析误差的前提下，也可采用外标法定量。当采用顶空进样时，由于供试品和对照品处于不完全相同的基质中，故可采用标准溶液加入法以消除基质效应的影响；当标准溶液加入法与其他定量方法结果不一致时，应以标准加入法结果为准。任务二：仪器分析法气相色谱法气相色谱法

1.概述

气相色谱法系采用气体为流动相（载气）流经装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。气相色谱具有分辨效能高、供试品用量少、选择性能好、灵敏度高、分析速度快、应用范围广等特点。气相色谱主要用于分离测定一些气体及易挥发性物质，不适用于高沸点、难挥发、热不稳定物质的分析。被分离组分的定性较为困难。气相色谱法

2.原理

气相色谱分离是利用试样中各组分在色谱柱中的气相和固定相间的分配系数不同，当气化后的试样被载气带入色谱柱中运行时，组分就在其中的两相间进行反复多次的分配（吸附—脱附—放出）。由于固定相对各种组分的吸附能力不同，因此各组分在色谱柱中的运行速度就不同，经过一定的柱长后，便彼此分离，顺序离开色谱柱进入检测器，产生的离子流信号经放大后，在记录器上描绘出各组分的色谱峰。任务二：仪器分析法气相色谱法气相色谱法固定相

一般来说，宜按照“相似性”原则选择固定液：分析非极性样品时用非极性固定液，分析强极性样品时用极性强的固定液。把固定液涂敷在开管柱的内壁，或涂渍在载体上制成填充柱的固定相，均勿太厚。开管柱的固定液的液膜厚度宜为0.2~0.4μm，填充柱的固定液含量宜为3%~10%。载体颗粒约为柱径的10%，即80~100目较好。在这种情况下，组分在液相中传质快，载体粒度较小而又未增大填充不均匀性，有利于在较低的温度下分析高沸点组分及缩短分析时间。气相色谱法流动相

即载气,可用氦气、二氧化碳、氢气、氮气等。载气的选择与纯化的要求取决于所用的色谱柱、检测器和分析项日的要求,如对有些固定相不能与微量氧气接触,又如对热传导池检测器宜用氢气做载气;对电子捕获检测器须除去载气中负电性较强的杂质，以利于提高检测器的灵敏度。用相对分子质量小的气体作载气时可用较高的线速，这时柱效下降不大，却可以缩短分析时间，因为相对分子质量小的气体黏度小，柱压增加不大，并且在高线速时可减少气相传质阻力。用氢气作载气时，在填充柱和开管柱中的流速可分别选用35mL/min,2mL/min。任务二：仪器分析法气相色谱法气相色谱法

气相色谱仪结构气路系统进样系统分离系统温控系统检测记录系统气相色谱法

（1）气路系统气相色谱法

（2）进样系统气相色谱法（3）分离系统

分离系统由色谱柱组成，它是色谱仪的核心部件，其作用是分离样品。色谱柱主要有两类：填充柱和毛细管柱。

1）填充柱填充柱由不锈钢或玻璃材料制成，内装固定相，一般内径为2～4mm，长1～3m。填充柱的形状有U型和螺旋型二种。

2）毛细管柱毛细管柱又叫空心柱，分为涂壁，多孔层和涂载体空心柱。涂壁空心柱是将固定液均匀地涂在内径0．l～0.5mm的毛细管内壁而成，毛细管材料可以是不锈钢，玻璃或石英。毛细管色谱柱渗透性好，传质阻力小，而柱子可以做到长几十米。与填充往相比，其分离效率高（理论塔板数可达106）、分析速度块、样品用量小，但柱容量低、要求检测器的灵敏度高，并且制备较难。

气相色谱法（4）温控系统

在气相色谱测定中，温度是重要的指标，它直接影响色谱柱的选择分离、检测器的灵敏度和稳定性。控制温度主要指对色谱柱炉，气化室，检测器三处的温度控制。色谱柱的温度控制方式有恒温和程序升温二种。对于沸点范围很宽的混合物，往往采用程序升温法进行分析。程序升温指在一个分析周期内柱温随时间由低温向高温作线性或非线性变化，以达到用最短时间获得最佳分离的目的。气相色谱法（5）检测记录系统这个系统是指样品经色谱柱分离后，各成分按保留时间不同，顺序地随载气进人检测器检测器把进入的组分按时间及其浓度或质量的变化，转化成易于测量的电信号，经过必要的放大传递给记录仪或计算机，最后得到该混合样品的色谱流出曲线及定性和定量信息。任务二：仪器分析法紫外——可见分光光度法紫外—可见分光光度法

1.概述

分光光度法是基于被测物质的分子对光具有选择吸收的特性而建立的分析方法。根据测定时所选用的光源

紫外分光光度法可见分光光度法红外分光光度法紫外—可见分光光度法

1.概述

紫外-可见吸收光谱：分子中价电子能级跃迁。波长范围：200-760nm(1)紫外光区:200-400nm，可用于物质的定性和定量分析。(2)可见光区:400-760nm，可用于有色物质的定性和定量分析。二者合成紫外—可见分光光度法，即UV-Vis。紫外—可见分光光度法

2.原理

紫400红660橙600黄560绿530蓝绿500绿蓝450蓝420紫外—可见分光光度法

2.原理溶液的颜色：是由于它选择性地吸收了一部分光，而呈现它的补色。例如：三(邻二氮菲)合铁配合物溶液吸收了508nm处的光，而呈现紫红色。光的互补：若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补色的光。紫外—可见分光光度法

2.原理

将某物质的溶液，用不同波长的单色光作入射光，测定这一溶液吸光度A。每种波长的单色光都有其相对应的吸光度。然后以A为纵坐标，波长为横坐标作图，所得曲线即为该溶液的吸收光谱。

max=515

A480520560nm紫外—可见分光光度法

2.原理光吸收的基本定律Lambert-Beer定律A=lg(1/T)=Kbc