分光光度法测定连钱草中总黄酮含量

分光光度法测定连钱草中总黄酮含量

连草也被称为活血丹和头骨消灵活。这是嘴唇科多年生草本植物的活血丹[glechoma]kubar]干燥的土壤。它具有辛、甜、性寒、清热解毒、利尿、祛瘀、消肿等功能。连钱草分布于除西北以外的全国各地。连钱草茎叶中含有多种活性化学成分,其所含黄酮类化合物具有广泛的药理活性,同时对心脑血管疾病和免疫系统等有多种药理作用和治疗功效。但是此药材叶易脱落,目前对其所含总黄酮测定常用高效液相法、分光光度法、比色法,但鲜有对测定连钱草中各部位的总黄酮含量的分布情况进行分析报道。本文对连钱草的全草、叶和茎中的总黄酮含量分别进行测定,为进一步提高连钱草的质量控制提供依据。1仪器和试剂1.1药材、药品与仪器UV-3050型紫外-可见分光光度计(日立仪器有限公司),AR2140电子分析天平,DGB/20-002台式干燥箱(重庆试验设备厂),FS-300超声处理器上海生析超声仪器有限公司),AA-200电子天平(美国丹法),药材采自广东云浮腰古街附近,采集时间均为采收期9月底和10月底,由云浮药检所李泳斌研究员鉴定为唇形科植物活血丹G.longituba,置通风处晾晒至干的干燥地上部分。1.2试剂芦丁对照品(中国药品生物制品检定所);水为纯化水,其余试剂亚硝酸钠、三氯化铝、氢氧化钠等均为AR级。2方法2.1供试品溶液制备样品按茎、叶和地上部位(全草)分离后置恒温干燥箱中于120℃干燥6h,各精密称取样品粉末约0.5g(过60目筛)置100ml具塞容量瓶,精密加60ml60%乙醇,密塞,称重,超声提取后放冷,密塞,再称重,加60%乙醇至刻度,振荡,过滤,取续滤液为供试品溶液。2.2对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品0.0076g并于100℃常压干燥至恒重,置于50ml容量瓶中,用30ml60%乙醇超声溶解,放冷,加乙醇定容得芦丁对照品溶液0.0152mg/ml。2.3黄酮的总含量2.3.1测量波长的选择根据实验经验和文献报道,确定检测波长为510nm。2.3.2空白对照测定精密量取芦丁对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml,置于25ml容量瓶中,分别加入60%乙醇6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0ml使体积成6ml,精密加入5%亚硝酸钠1.0ml,摇匀,放置10min;精密加入10%三氯化铝1.0ml,摇匀,放置10min,加入5%的氢氧化钠5ml,用60%乙醇添加至刻度,以第一管(无芦丁对照品)作为空白对照,在510nm处测定吸光度。以浓度-吸光度绘制曲线,求得回归方程为:Y=0.0736X+0.0019(r=0.99656,n=6),表明芦丁对照品在0.0152～0.076mg/ml范围内呈良好的线性关系。2.3.3吸光度测定取芦丁对照品适量,配成测定范围浓度对照品试液;另取供试品(全草)约1g,按照2.2方法配制成供试液。各取溶液分别测量5次,显色后测定吸收度。结果表明,测定方法的精密度良好,见表1。2.3.4总黄酮含量的测定取对照品溶液4.0ml,进行显色,每隔6min测定一次吸收度,并测定至60min,计算总黄酮的平均含量为(0.0582mg/ml),RSD=3.12%(n=11),结果表明显色后的溶液在42min(n=8)内稳定。2.3.5供试品溶液配制取野生和种植的连钱草粉末各3份,重量分别为1g,精密称定,按“2.2供试品溶液配制”项下的方法提取。精密量取供试品0.5ml,显色后测定吸收度,测得总黄酮的平均含量分别为76.92mg/g、58.29mg/g,RSD分别1.8%、1.1%(n=3),结果表明该方法重复性良好。见表2。2.3.6供试品溶液的制备已知总黄酮含量的连钱草粉末约0.2g,加入芦丁对照品适量,精密称定,按“2.1供试品溶液配制”项下的方法提取。按样品测定的方法测定其含量,计算加样平均回收率为102.2%,RSD值为1.92%(见表3)。2.3.7总黄酮含量的测定将一定量的连钱草。根据不同样品及不同部位处理后,采用优化后的超声波法提取其总黄酮,按照与制作标准曲线相同的显色过程,按“2.3.2”项下方法在最大吸收波长处测定吸光度测定,并按回归方程计算连钱草中的总黄酮量,结果见表4。样品中总黄酮含量(mg/g)=(C×V)/M×100式中。C为试液中总黄酮浓度(mg/ml);V为试液的定容体积(ml);M为样品质量(g)。3黄酮类化合物目前,黄酮类提取通常有回流及索氏、超临界流体萃取、酶法、溶剂萃取等方法,各有优胜,亦有不足。本实验在单因素试验基础上进行正交设计优化发现,用超声提取在功率600W,超声时间60min,提取温度40℃,溶剂浓度65%提取效果最佳,其中影响连钱草总黄酮提取率的因素中,温度和溶剂浓度为主要因素。适当增加温度可以提高溶剂的溶解度,但温度过高又会使溶剂挥发,另外适当溶剂的浓度有利于总黄酮的快速溶出,与文献报道相符。野生和种植连钱草的总黄酮含量差异较大,以全草为例其中野生总黄酮的平均含量为78.12mg/g,而种植的为57.96mg/g,其不同部位的叶子和茎亦相对较高,其部位总黄酮含量亦相对的稳定(见表4),这可能与栽培方式、不同的气候、生长环境土壤条件、光合作用条件等因素相关,应进一步深入研究。目前对于黄酮类化合物的含量测定常用的方法包括有比色法、紫外分光法和高效液相法等。但比色法受杂质干扰较大,容易影响结果,使结果偏高,高效液相法条件苛刻,实验成本较高。据研究,连钱草中的黄酮类成分较多,包括芹菜素、木