免疫组化资料

主要实验耗材和试剂盖玻片，载玻片，塑料包埋盒/PlasticEmbedBox，切片刀，切片储存盒/plasticbox，磷酸缓冲溶液/PBS，二甲苯，无水乙醇，苏木素染液（哈瑞氏），PBS缓冲液（pH7.2～7.4），柠檬酸盐缓冲液，多聚甲醛，过氧化氢，中性树胶，免疫组化试剂盒（这个用的是SABC）。相关机器组织脱水机，石蜡包埋机，冷台，染色，封片机，摊片机，烤箱，倒置荧光显微镜，微波炉，钢玻璃架。

实验方法1.实验样品的采集与固定

（1）用活检针取组织块，轻置于含有4%中性多聚甲醛溶液的50ml离心管至少6个小时。组织与溶液的体积比小于1:20；

（2）样品固定于新配制的中性多聚甲醛固定液（15ml离心管），24小时以上，使组织充分固定准备脱水。2．组织脱水（使用组织脱水机）

（1）装载组织前，确认仪器状态；确认所有石蜡和试剂缸的液体水平（位于最低刻度以上）；确认所有试剂未过期；确认组织脱水缸洁净。

（2）装载组织：确认脱水组织的实验编号，包埋盒数量。将要脱水的组织包埋盒放入脱水篮，盖上脱水篮盖，再放入脱水缸中，盖上并锁紧脱水缸盖。（3）程序选择及确定：确认并选择脱水程序。需要时可以使用延迟功能。（4）脱水运行机。程序开始后，再次确认脱水程序设置。（5）脱水程序结束后，及时将组织从脱水机内取出。（6）运行清洗程序。

通过Lecia

ASP200S全自动组织脱水机完成脱水过程；相关程序如下：

a)

10%NBF5~6hr;

b)

70%乙醇溶液45min;

2.4将组织块固定于切片机色夹槽内的理想位置。

2.5根据生产商的使用说明书旋转粗修轮把手（coarsewheel）进行粗修，使蜡块缓慢的向前推进，小心的修掉蜡，知道暴露所需的组织平面。

2.6

开始切片，首先设置切片厚度，向前旋转切片转轮，转把手直至蜡片形成。锁定切片轮转把手，用镊子或毛笔等移动蜡片铺在摊片机水面上，注意不要损坏刀口。

2.7完成切片后，锁定轮转把手，小心地取出蜡块。

2.8

切片过程中，可移动切片刀至未使用的刀口或更换新的切片刀。需要小心清理刀上的蜡屑，不要损伤刀口。3.3水浴的使用

3.1

使用前检查，包括电源情况。

3.2

清洁水浴里的石蜡或灰尘。

3.3

往水浴里倒满水，自来水，蒸馏水或去离子水均可(适用时)。

B.切片机的使用

2.1装蜡块前，应确保切片轮把手（hangwheel）处于锁定状态，刀架保护套开启。清洁刀架上的蜡屑（存在时）。

2.2小心插入未使用过的一次性切片刀片，确认刀片放入了刀架中的适当位置，根据生产商的使用说明书锁紧刀架。

2.3确认刀片的倾角。一般应设置为3—6度（需要时）。

2.4将组织块固定于切片机色夹槽内的理想位置。

2.5根据生产商的使用说明书旋转粗修轮把手（coarsewheel）进行粗修，使蜡块缓慢的向前推进，小心的修掉蜡，知道暴露所需的组织平面。

2.6

开始切片，首先设置切片厚度，向前旋转切片转轮，转把手直至蜡片形成。锁定切片轮转把手，用镊子或毛笔等移动蜡片铺在摊片机水面上，注意不要损坏刀口。

2.7完成切片后，锁定轮转把手，小心地取出蜡块。

2.8

切片过程中，可移动切片刀至未使用的刀口或更换新的切片刀。需要小心清理刀上的蜡屑，不要损伤刀口。3.3水浴的使用

3.1

使用前检查，包括电源情况。

3.2

清洁水浴里的石蜡或灰尘。

3.3

往水浴里倒满水，自来水，蒸馏水或去离子水均可(适用时)。

3.4打开水浴（仪器后面电源），按控制面板上的”RUN/STOP”键使水温达到理想的温度，可为42摄氏度至47摄氏度。

3.5

待上述切片无明显分褶皱时，用干净的载玻片与水面倾角约45°将切片粘贴于载玻片中1/3和下1/3的中间。

3.3.5

摊片机使用结束后，关闭水浴。倒掉水浴内的水（使用时）。

3.4.3

使用结束后关闭摊片机电源，关闭冷台清理上面的霜。烤片：将片子放入60度烤箱1小时进行固定（可选）。

脱蜡：依次将载玻片放入二甲苯40min-100%酒精5min-100%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min，起脱蜡作用的主要是二甲苯,依据的是相似相溶的原理.

抗原修复：将切片至于柠檬酸盐缓冲液中，放入微波炉中蒸煮8min（高火），冷却5min，然后再蒸煮一次（低火10min），冷却至室温，蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。消除内源性过氧化物酶活性：3%过氧化氢孵育20min，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗3min，3次。

血清封闭：冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗2次，并将载玻片置于PBS中5min，洗2次，擦干组织周围的PBS液，马上加上血清，使一些非特异性的位点封闭起来，然后放入37°C温箱中半小时。血清稀释10（900µlPBS：100µl血清封闭液，可以根据实验自己选择合适的浓度）。

加一抗：将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，加一抗，如果做对照实验，就在对照的组织上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存过夜。

加二抗：将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上二抗,然后置于37°C温箱中半小时。

加SABC:将片子从温箱中取出,放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上SABC,然后置于37°C温箱中半小时。SABC稀释100倍（990µlPBS：10µlSABC）。

加显色剂：将片子从温箱中取出,放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上显色剂。（显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀）

A.DAB

B.H2O2

C：磷酸缓冲液

复染：将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色，一般动物组织为半分钟，植物组织3-5min。

脱水：将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入70%酒