葡萄糖转运蛋白glu4的提取纯化及晶体结构解析

葡萄糖转运蛋白glu4的提取纯化及晶体结构解析

glut4分子功能与结构解析葡萄糖运动性蛋白（glcosetransporter4）广泛存在于高等哺乳动物肌肉和脂肪中。这是一种12倍的糖蛋白。这种参与控制人体葡萄糖的平衡起着重要作用。越来越多的证据表明，糖蜜4与移植障碍有关。GLUT4在脂肪细胞和肌细胞中表达,胰岛素刺激GLUT4分子转移到细胞膜上,促进葡萄糖分子的转运过程。GLUT4分子功能与结构信息对于研究糖尿病的胰岛素释放障碍和胰岛素抵抗机制有重要意义。GLUT4蛋白的三维结构解析有助于我们深入了解糖尿病发生的分子机制,而得到GLUT4蛋白晶体的关键是获得足够的蛋白产量和纯度。目前世界上还尚未有关于体外组织大规模纯化GLUT4的相关报道。本文我们首次尝试选用较大的哺乳动物作为原材料,采用组织提取方法初步分离和纯化了GLUT4。1材料和方法1.1冰上放置时间新鲜猪肉脂肪组织取自于家猪皮下脂肪部位,购买于北京市第五肉联厂。为防止组织腐烂,应在冰上放置当天实验或者-20℃冻存。GLUT4单克隆抗体1F8由DavidE.James博士馈赠。1.2实验处方1.2.1tis/hc1的研磨法破碎细胞首先,将150g脂肪组织用冰冷的生理盐水浸泡,除去一些杂质和残留的血液,然后用无菌剪刀将组织剪切成小块,加入3-5倍体积(约400mL)的预冷匀浆缓冲液(20mmol/LTris/HC1,pH7.4,0.25mol/L蔗糖,1mmol/LEDTA,1μmol/Lpepstatin,1μmol/Lleupeptin),通过切片式匀浆器将组织进一步破碎匀浆成稀糊状溶液(10次,8s/次)。其次,将稀糊状匀浆液置于细胞捣碎器的磨沙玻璃筒内,体积不超过其1/3,将研磨棒缓慢深入匀浆液中,调速器转速打到最慢,开动马达,逐步加速到所需速度(3000-4000rpm)。捣碎过程注意维持低温,筒外可放置冰水浴。最后,脂肪组织通过匀浆和破碎后,将不能分解的油脂用双层纱布过滤除去。匀浆液置于冰上保存。1.2.2沉淀和上清fps的制备匀浆液用1200g离心10分钟,以除去未匀浆破碎完全的组织碎片和漂浮液面上的油脂层,收集上清(F)。上清(F)16,000g离心10分钟,去除上层油脂,收集上清(F1)和沉淀(P1),上清(F1)用48,000g离心30分钟,收集上清(F2)和沉淀(P2),上清(F2)用210,000g离心50分钟,收集上清(F3)和沉淀(P3),以上沉淀均用匀浆缓冲液重悬。超速离心机型号为日立CP100-MX。1.2.3硫酸铵提纯条件GLUT4通过差速离心分离得到的含GLUT4的上清,约200mL,逐步加入硫酸铵并缓慢搅拌,选取5个硫酸铵浓度梯度范围0-35%,35%-45%,45%-55%,55%-65%和65%-85%进行初步提纯。每一步得到的沉淀通过16,000g离心,并用匀浆缓冲液重悬沉淀。1.2.4单抗转膜制备通过分离纯化的各组分样品通过12%SDS进行分离,然后40V电压下转膜过夜,脱脂牛奶封闭,依次通过GLUT4单抗1F8和二抗孵育,最后通过碱性磷酸酶法显色。2结果2.1glut4结构组织的分离和鉴定在基态下,GLUT4大部分存在于脂肪细胞内膜结构组织中。根据一般内膜组织提取实验证实,在44,000g离心转速下大部分密度较大的膜结构组织,包括质膜,内质网膜等都被离心沉降,而210,000g离心转速可将大部分的密度小的内膜结构组织分离沉降,因此,我们利用内膜组织的物理特性选用1200g,16,000g,48,000g,210,000g四个转速来差速分离富含GLUT4的脂肪细胞内膜结构组织。我们对每一步差速分离的上清和沉淀进行了SDS和WesternBlot检测(图1:A和B)来分析差速分离后的GLUT4定位。根据WesternBlot检测,我们发现在55kDa左右有一条被GLUT4的单克隆抗体1F8特异识别的条带,并且大小与文献报道GLUT4蛋白大小相吻合。根据结果显示,在差速离心分离的每步组分中都检测到了GLUT4,而且,最后一步差速分离后得到GLUT4大部分存在于上清F3中。在传代培养的3T3-1脂肪细胞提取研究中发现富含GLUT4的内膜组织在180,000g离心作用下被分离沉淀出来。通过比较认为,我们在大规模提取组织细胞中采用了较为剧烈的匀浆研磨过程,脂肪组织细胞中相当多的内膜结构遭到破坏,富含GLUT4的内膜组织碎片大部分仍游离于上清中(图1,A:F3)。2.2glut4的纯化通过差速离心分离,我们虽然检测到GLUT4的存在,但是通过SDS显示,样品中蛋白成分非常复杂(图1,A)。为了得到更纯的GLUT4,我们选用传统的硫酸铵沉淀法初步纯化了富含GLUT4的F3组分。传统的硫酸铵分级沉淀法对于GLUT4的纯化效果十分显著。我们发现在35-55%的硫酸铵浓度范围内,GLUT4得到了大量富集纯化,同时这一结果得到了WesternBlot的验证(图2)。35-55%的硫酸铵浓度范围沉淀得到的GLUT4约为40mg,通过10mL磷酸缓冲液PBS(含0.5%DM)重悬来测定浓度。纯化后的GLUT4在去污剂DM存在下可以稳定存在3天。通过对每步硫酸铵分级沉淀得到的蛋白进行定量,得出了在35-55%的硫酸铵浓度范围内沉淀得到的蛋白大约有40mg(表1),得到的GLUT4纯度大约由原来的5%上升到50%(图2,A)。3glut4的纯化由于GLUT4是具有12次跨膜结构的内在膜蛋白,目前通过融合表达体系表达具有多次跨膜蛋白的方法技术鲜有报道。究其原因,一是膜蛋白很难在体外表达体系中正确折叠和修饰,二是即使表达,蛋白的产量也很难提高,特别是利用真核表达系统的话将耗费相当大的资金。根据GLUT4在体内的功能定位实验证明,为了可以在胰岛素刺激的条件下迅速转运体外血液中的葡萄糖进入细胞内代谢,GLUT4蛋白在细胞膜上含有相当可观的拷贝数,因此我们根据前人在脂肪细胞和肌肉细胞中GLUT4研究的一些工作为基础,首次尝试了利用家猪的脂肪组织作为原材料,利用差速离心方法和硫酸铵沉淀方法初步提取和纯化了GLUT4。与在细胞提取或者小规模组织提取GLUT4不同的是,大规模组织提取需要在匀浆前利用刀片高速剪切组织,差速离心分离后大部分GLUT4存在于离心上清中,这主要是因为细胞膜的破碎,导致含有GLUT4的小的膜碎片无法沉淀下来。我们在猪脂肪组织的差速离心分离样品中检测出较丰富的GLUT4,并且进一步通过硫酸铵沉淀法成功纯化了GLUT4,说明脂肪组织是提取纯化GLUT4的理想材料。在150g脂肪组织中,于35%-55%的硫酸铵沉淀浓度范围内得到40mg纯度达到50%的GL