细胞内微泡形成的分子机制

细胞内微泡形成的分子机制

囊泡概念和细胞外科医生物化学价值一、evs的分类esr是一个由细胞源的双分子层组成的球形膜层，包括通常提到的微气泡和外部体。EVs是一组直径介于40~5000nm间的囊泡状小体,多种细胞均可向其生存的微环境中分泌EVs。EVs可携带多种生物活性物质,如蛋白酶、各种生长因子及受体、组蛋白、mRNA、miRNA及起源细胞的分子标志等,并把这些生物活性物质由起源细胞转移至靶细胞。由于EVs是一组异质性较大的群体,因而有很多描述EVs的术语,如外来体、微泡、膜性颗粒、纳米颗粒、微粒体、凋亡小体、致癌小体(来源于肿瘤细胞的外来体)、形似外来体的囊泡等。但这些术语易引起歧义,而外来体和微泡正逐渐被广大学者接受和使用,且歧义较少。目前,依据微泡的不同起源可将EVs分为3种类型,即脱落微泡、外来体和凋亡小体,其各类型的特征详见(见表1)。目前发现,多种类型的细胞都能产生EVs,包括各种造血系统的细胞,如血小板、巨核细胞、单核细胞、中性粒细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞,网织红细胞和肥大细胞等。多种干细胞和前体细胞,如造血干细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞、内皮干细胞、肿瘤细胞及多种细胞株在体内、外均可产生微泡。最新研究证实,非造血器官中的上皮和内皮细胞也可分泌EVs,如肺泡上皮细胞。微泡主要存在于细胞生存的微环境中,目前已能从细胞培养的上清液及各种体液(如血浆、血清、唾液、乳汁和尿液等)中成功分离出EVs。研究发现,多种机制参与了EVs的形成,脱落囊泡的形成与细胞内钙离子浓度密切相关,且在脱落囊泡形成的过程中可能有膜受体的参与,进而引起细胞膜的重构和囊泡脱落。外来体的形成不仅依赖胞内钙离子浓度的变化,还可能与细胞表面各种受体的活化密切相关。在一定条件下,细胞可自发分泌外来体,如肿瘤细胞株和EBV感染的B淋巴细胞等。刺激EVs形成的其他因素还包括细胞癌性转化、细胞应激、细胞活化、氧化应激、细胞死亡和(或)凋亡、细胞损伤(如放射损伤)等。二、囊泡在免疫治疗中的重要作用EVs所包含的物质与其类型及起源密切相关,因而不同类型和起源的囊泡功能也有所不同。目前研究发现,EV可在各种生理和病理生理条件下传递细胞间信息,即通过传递遗传物质、转移受体、信号分子等方式影响其他细胞。囊泡在免疫反应、生理稳态维持、血管生成、血栓形成及肿瘤浸润和转移等方面具有重要作用。目前,大量研究都试图通过分析各种生理和病理条件下囊泡发挥信息传递作用的具体分子机制,来阐明其病理生理过程,并期望能将囊泡作为将来治疗各种疾病的靶点或早期诊断的生物标志。Grang等的一项研究发现,肾癌干细胞来源的微泡能促进肿瘤新生血管的形成。Dai等的一项研究已经将腹水来源的微泡用于结肠直肠癌的免疫治疗。Mitchell等的研究发现,根据血流中微泡所含miRNA种类和含量的不同可对特定人群进行早期的肿瘤筛查。evs分离和纯化目前已开发出了很多分离和纯化EVs的技术和方法,如差速离心法、蔗糖密度梯度离心法、抗体标记的磁珠分选、微孔过滤技术、ExoQuickTM试剂盒和微流控技术等。但是在目前最大的问题是缺乏标准且高效的EVs分离方法和技术。现有的EVs分离和纯化方法在实际应用中均存在较多的缺点和限制。以下主要探讨目前EVs的各种分离和纯化方法,及每种方法在实际应用过程中的优缺点。一、超高速离心目前,差速离心法被认为是分离EVs的标准方法,且已被广泛用于细胞培养上清液和各种体液中囊泡的分离。尽管不同单位的分离步骤有所差异,但主要有以下几个步骤。(1)首先是低速离心,一般转速为300×g,离心10min,此步骤是为了去除细胞。(2)再把上清液高速离心,转速在(2000~10000)×g间,随转速的增加,离心时间可适当缩短,一般为10000×g离心30min,此步骤主要为了去除死亡的细胞和大的细胞碎片。(3)最后为超高速离心,即对前述的上清液进行超高速离心,转速通常为100000×g,一般离心70min。若想去除蛋白质的干扰得到较高纯度的EVs,可在超高速离心后用大量PBS缓冲液重悬,然后重复超高速离心,再弃去上清后用适量PBS缓冲液重悬,即为分离所得的EVs。将其放置到-80℃的冰箱内保存(可保存1年,切忌反复冻融),以备后续检测和使用。以上所有离心步骤均在4℃条件下进行。然而,差速离心分离法所需时间较长,一般需要4~5h;且分离过程中需要超高速离心,此步骤对EVs数量影响较大,因而分离得到的EVs的产率较低。此外,该方法分离得到的EVs的纯度也较低,常混有蛋白质和核酸碎片等杂质。待分离样本的黏度也会影响EVs的产率,可将黏度较高的液体进行适当稀释,然后再按照上述步骤进行分离。虽然分离纯化后的EVs数量可在室温下保持3~4d不变,但一般建议储存在-80℃冰箱中;反复冻融对EVs活性和数量影响较大,每冻融一次,EVs的数量会损失10%~15%。二、蔗糖分离步骤为去除差速离心法得到EVs中混有的蛋白质和核酸等杂质,可用蔗糖密度梯度离心,其能依据不同物质浮选密度的不同进一步纯化EVs。外来体在蔗糖梯度溶液中的浮选密度为1.08~1.22g/mL,而微泡的浮选密度为1.18~1.25g/mL。故可根据需要配置上述不同密度的蔗糖溶液,尽管不同单位的分离步骤有所差异,但主要包括以下几个步骤。首先是用25mL的PBS缓冲液重悬差速离心法得到的EVs,并加入约4mL适当浓度的蔗糖溶液至离心管中;将EVs稀释液缓缓加入到蔗糖溶液界面的上方,4℃下进行100000×g高速离心70min;离心结束后,用5mL注射器抽取约3.5mL的蔗糖溶液,并转移至超速离心管中,并用PBS稀释至60mL,然后再次离心,4℃下100000×g离心70min;最后弃去上清液,并用50~100μL的PBS液重悬,所得即为EVs。三、差速离心法微孔过滤技术是近年刚开发的一项分离EVs的新技术。常与差速离心法配合使用,用于取代差速离心法中前两步的离心步骤,其作用也是为了清除死亡细胞、较大的细胞碎片和凋亡颗粒。虽然微孔分离技术与差速离心联合能缩短EVs分离所需时间,但该方法会降低EVs的产率,且分得EVs中混有较多的蛋白质杂质。四、胞来源的evs分离关于EVs蛋白质组学的研究发现,EVs可表达一些囊泡共有蛋白和细胞特异性的蛋白,而这些蛋白可作为分子标志用于EVs的分离。目前,使用抗体包被的免疫磁珠已能成功分离多种细胞来源的EVs,其分离方法主要包括以下几个步骤。首先把待测样本(一般为2mL)与标记目标EV抗体的免疫磁珠(一般约50μL)混匀,在室温下置于摇床上孵育2h;再把分离柱放到分离器的磁铁架上,并用500μL的PBS润洗分离柱;然后将孵育结束后的待分离样本缓缓加入到分离柱中,弃去废液;将分离柱移出磁性分离器;最后用PBS冲洗分离柱,收集冲洗分离柱所得到的液体,即为含有目标EVs的液体。但用此方法分离得到的EVs活性受到一定影响,不利于后续的EVs的功能分析和研究,且不适用于大体积样本的分离。五、微流控装置工作原理微流控技术是一种在微观领域研究和操控液体流动的技术。这种微流控技术和微型化的芯片装置对于临床诊断和血液分析非常有用。微流控装置可利用EVs与抗体包被界面的特异性结合来分离EVs,将待测样本加入装置后,装置内微型泵促使液体流过芯片,在流动过程中达到分离EV的目的。使用此技术的设备结构复杂,具体详细步骤不再论述。该分离EVs的方法具有快捷、省时、高效的特点,但不适合体积较大样本的分离,一般每小时仅能分离400~500μL样本。六、误吸分离试验目前,许多国际知名的生物科技公司都在竞相开发能从各种体液中快速、简单地分离EVs的方法。目前最成熟的是由美国Biosciences公司生产的ExoQuickTM试剂盒。使用此试剂盒能够克服差速离心法耗时较长和所得EVs纯度低的缺点。Taylor等分析并比较了各种EVs分离的方法,发现使用ExoQuickTM试剂盒分离得到的EVs中所含miRNA的纯度和数量要高于其他方法。但目前仍需进一步研究以证实此类试剂盒的适用性。evs的分离与纯化目前对于EVs研究有了一些进展,对微泡的起源、组分及其部分功能有了初步了解,微泡在疾病诊断和治疗方面的作用已崭露头角。Fleitas等的一项研究发现,血流中的微泡和内皮细胞可作为判断终末期非小细胞肺癌预后指标。Rank等的研究发现,血浆中红细胞来源的微泡有助于异基因造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病的诊断。Cantalupp等的一项研究发现,内皮前体细胞来源的微泡有助于保护肾脏的缺血再灌注损伤。在中风动物模型研究中发现,间充质干细胞来源的囊