动物细胞融合

实验二十六动物细胞融合实验目的了解动物细胞融合的常用方法。学习化学融合的基本操作过程及其应用。观察动物细胞融合过程中细胞的行为和变化。实验原理细胞融合:指在培养或诱导条件下，两个或两个以上细胞合并为双核或者多核细胞的过程；又叫细胞杂交，分为同核和异核。成功的标志为：融合后的细胞能正常分裂、生长。动物细胞融合的方法：病毒诱导融合：利用仙台病毒等被膜中含有融合蛋白的病毒，通过改变动物细胞细胞膜的脂双层促使动物细胞融合。化学诱导融合：利用化学试剂如聚乙二醇（PEG），利用相似相溶的原理，改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。在恢复过程中相接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞融合，胞质流通，发生融合。融合过程：细胞接触一一膜融合一一形成哑铃型细胞。化学诱导融合方法，操作方便，融合效率高。附：PEG的分子量：400-6000道尔顿，其中科研时采用800-1000道尔顿。PEG的浓度：40%-60%作用时间：1分钟（科研）PH：8.0-8.2温度：38-40°C电激诱导融合：基于显微镜下的细胞融合，其中电诱导（激光诱导）是先使细胞在电场中极化成为电偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲（激光）击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融合。电激诱导融合方法具有无毒高效的优点。本次实验选用化学诱导融合方法。实验用品材料：鸡血红细胞。试剂：0.85%氯化钠溶液，GKN溶液（磷酸缓冲液），Alsever’s细胞保存液，50%PEG。器材：显微镜、离心机、离心管、载玻片、盖玻片。实验步骤取鸡血2ml+2mlAlsever液，再加入6mlAlsever液，混匀后制悬液。（可在4C保存）往离心管中取①1ml+4ml0.85%的NaCl溶液，进行一次1000r/min、5min离心取出离心管，抽出上清液，加入GKN液4ml使细胞浓度适宜，采用吹气泡等方法混匀，制成悬液。取出三个离心管：第一个加入1ml，第二个加入0.5ml，第三个加入0.5ml上述悬液。在第一个管中加入0.5mlPEG溶液，接触30-40s时混匀；在第二个管采取上述相同操作；在第三个管中加入1mlPEG溶液，接触少于30s后混匀；静置2-3min。分别取上述溶液制成装片，在显微镜下观察并记录三个条件下的融合情况以及融合过程。实验完毕后，清洗实验器材并置于原处。实验结果

接触融合融合后1ml+0.5mlPEG0.5ml+0.5mlPEG0.5ml+1mlPEG接触融合融合后1ml+0.5mlPEG0.5ml+0.5mlPEG0.5ml+1mlPEG由实验结果可得随着PEG的浓度的增加，细胞的融合率不断增加;同时细胞变形所需的时间越短.故而，在科研过程中PEG作用的时间应维持在1min左右.同时细胞浓度越小，融合率越高.分析与讨论在观测过程中发现有细胞堆积的现象,不易于观察,因此在实验过过程中，应注意控制细胞浓度,且在两次混匀时要注意彻底混匀.1ml(0.5ml)细胞溶液+0.5mlPEG条件下，应注意在两者接触30-40S时在混匀,如此实验结果会更明显，但在0.5ml细胞溶液+1mlPEG条件下，接触时间应少于30s.以免细胞变形.在实验过程中，应在作用2-3min后在观察，但时间不应太久,否则细胞变形将影响观察.在观察中应将光圈调小，如此实验结果将更明显.在观察过程中应仔细耐心,注意区分重叠和接触的不同.动物细胞融合的应用动物细胞融合是从细胞水平来改变动物细胞的遗传性，用于生产单克隆抗体、疫苗等特定的生物制品，改良培育动物新品种，缩短动物的育种过程。动物细胞融合的应用范围已广及生物学的各个分支学科，特别是在绘制人类基因图谱方面取得了显著成绩。虽然细胞杂交属于理论生物学范畴，但在实际应用方面也有重大突破。在基础理论研究上，动物细胞融合技术对研究细胞分化、基因定位、肿瘤发生机制等方面都有重要意义。在实际应用方面，动物细胞融合技术在药物定向释放系统、细胞治疗以及抗肿瘤免疫等方面起到重要的作用。动物体细胞杂交技术主要应用于以下几个方面。一、 用于基因定位和绘制人类基因图谱JP2杂种细胞中某一染色体或其片段的存在与否与细胞的某一性状表达与否相联系，从而可以实现把基因定位于某一染色体或某一区段上。1967年Weise和Green发现在人和鼠的融合细胞中，人的染色体优先丢失，并证明利用这一特点有可能对人染色体上的基因进行定位。1970年Ruddle等开始系统地用融合细胞作为实验系统来绘制人类基因图。二、 用于生产树突状细胞抗肿瘤疫苗一般认为肿瘤细胞表面抗原不能诱导强的免疫应答反应，树突状细胞(dendriticcells,DCs)与肿瘤细胞融合形成的树突状细胞疫苗能够有效地激发机体的细胞免疫应答，无论是在动物研究还是在人体早期临床试验中都证明这是一种方便、安全、可行的方法。并且由于融合细胞可以在体内存活，因此可以维持较长时期的免疫应答，有利于诱发机体产生有效的抗肿瘤免疫。肿瘤抗原可以肽段或完整蛋白的形式与DCs结合，或者将肿瘤抗原基因转化进DCs中，使其内源性地表达抗原，这两种方法在抗肿瘤免疫应答中均有效，但适于免疫的肿瘤抗原及其基因难以鉴定从而限制了其应用，有实验证明用这两种方法制备的肿瘤疫苗的免疫原性不及肿瘤细胞与树突状细胞直接融合的异核细胞，融合细胞保持了DCs和肿瘤细胞的特性，并且能高效地将未知的肿瘤抗原提呈给免疫系统.三、 用于生产单克隆抗体使小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合形成能产生单克隆抗体（monoclonalantibody,McAb）的杂交瘤细胞，单克隆抗体具有专一性和灵敏性，作为理论研究的工具在病原检测和疾病治疗以及食品安全领域具有广阔的应用前景。目前有关单位利用McAb作用的专一性这一特点正在探索用“生物导弹”对癌症进行早期诊断和治疗。四、 用于动物育种体细胞核移植技术（somaticcellnucleartransfertechnique,SCNT）是将细胞核移植到另一细胞的细胞质中的生物技术。动物体细胞融合后，杂种细胞难以发育再生为一个个体，但借助于细胞核移植的方法将融合后杂种细胞的细胞核移入去核成熟卵内，可培育新的杂种。另外，细胞核移植技术的建立，还为目前进行的哺乳动物体细胞克隆和转基因技术打下良好的实验基础。五、 用于细胞疗法SCNT将患者的任何体细胞与去核卵细胞融合，融合子进行有丝分裂形成囊胚，囊胚的内细胞团是多能干细胞，对多能干细胞进行诱导使其定向分化可形成所需的组织和器官用于器官移植，不仅解决了器官和组织来源问题，并且也避免了宿主对外来物的免疫排斥。六、 动物体细胞融合在基础理论研究方面的应用（1）用于研究细胞的核质关系和个体发育。20世纪70年代初，诞生了细胞拆合工程。Carter于1967年发现细胞松弛素B（CB）能诱发体外培养的小鼠L细胞的排核作用。Prescott等1972年首先应用离心术结合CB分离哺乳类细胞的胞质体获得成功，为研究哺乳类细胞的核、质相互关系、细胞质基因的转移开创了新的途径。异核体和细胞杂合子被用来确定基因调节因子，这些调节因子决定一个细胞表型消失或得以保持以及赋予受体新性状；通过对供体和受体细胞所有细胞特异性基因表达研究，细胞融合有助于人们了解发育，特别是在研究基因编码的可逆性方面。在个体发育过程中，血红蛋白存在着从胚胎型向胎儿型（幼虫）最终向成人型的转换，对这些转换进行研究，除了揭示基因顺序表达的调控机理外，在医学方面也有意义，人们可以部分或全部扭转从胚胎型向胎儿型的转变从而治疗镰刀型贫血病。（2） 用于揭示疾病发生的机制。与其他技术结合使用，细胞融合是一种揭示疾病机理的有效方法。例如，细胞融合与免疫荧光，生化分析，电镜技术相结合，LattanziG等对肌肉萎缩症发生的机理进行了研究。（3） 用于膜蛋白动力学研究