马铃薯愈伤组织诱导研究

马铃薯愈伤组织诱导研究

甘薯是属于茄子科的一种四度性植物。通常，它使用茎进行无性繁殖。在繁殖过程中，病毒和细菌容易受到污染，产量降低。通过几代的积累，可以实现种子退化。利用无菌操作通过组织和细胞培养,不但可产生去病毒的试管苗,还可以缩短生长周期,而进行大批量的快速繁殖。近20年来,我国在马铃薯组织培养和细胞培养方面也有一些研究报告发表。我国学者多采用MS培养基和勒新培养基作为基本培养基,用马铃薯不同部位作外植体进行离体培养。如中国科学院遗传研究所(1976)以MS培养茎尖;朱明凯等(1985)以MS培养花药;双宝等(1995)用MS培养叶片;李灿辉等(1998)也发表过有关马铃薯组织和细胞培养的研究报告。本文在前人研究的基础上,研究了用2,4-D、NAA、BA的不同浓度及组合,对马铃薯的茎尖、茎段、块茎进行愈伤组织诱导和不定芽的诱导效果。1材料和方法1.1材料表面采用生长健壮的马铃薯成年苗和马铃薯块茎作外植体。按照常规方法进行表面灭菌处理。1.2外植体诱导芽的制备诱导愈伤组织的培养基,以MS为基本培养基,蔗糖30g/L,琼脂8g/L,并附加不同种类和浓度的激素(表1),培养基灭菌前调pH值5.8～6.0,在121℃下灭菌18min(以下培养基均同此处理)。将外植体切成0.5～1.0cm的小段,每瓶接种3块,每处理接种10瓶。培养温度(23±2)℃,光照2500Lx,12h/d。诱导芽的培养基为:A.MS+NAA0.2mg/L(激素浓度均同此单位)+BA0.1;B.MS+NAA0.2+BA0.2;C.MS+NAA0.2+BA0.3。1.3小苗、马铃薯小苗的诱导生根采用MS+NAA0.4+BA1.0,每瓶接种一个芽,25～30d后将诱导的丛生芽分离,将其中生长、长势良好的马铃薯小苗转接至生根培养基,其余的单芽再行继代培养。1.4叶片的生根培养将苗高2.5～3.5cm,具有2～3片叶的单株转接生根培养基(MS+NAA1.5)中,在培养温度23±2℃,光照2500Lx,12h/d下进行培养。1.5苗木栽植培养将生长旺盛、根系发达的试管苗(4～5片叶,18条左右根)移入常温室内打开瓶盖放置,3d后从瓶内取出幼苗,洗净根部的培养基,移入盛有栽培基质(基质配方:砂:腐质土:碳渣,1:1:1)的小杯中,每小杯栽1苗,将小杯放入温室中培养。2结果与分析2.1,4-d处理分别以茎尖、茎段、芽体做外植体,试验了不同激素组合对诱导愈伤组织的影响,接种50d的统计结果见表1。3种外植体在4种培养基中均有愈伤组织产生,但出愈率有明显差异(在10%～37%之间)。当NAA为1.0时,用茎尖和芽体诱导,其出愈率分别达10%和20%,茎段没有愈伤组织形成;配方②、③、④,随着2,4-D浓度的增加,其诱导能力逐渐增强,出愈率也呈上升趋势,以④号培养基效果最好,用茎尖、茎段、芽体3种外植体愈伤组织的出愈率保持在33%以上,最高达37%。在②、③、④号培养基中,采用茎段做外植体诱导愈伤组织时,效果较用茎尖和芽体好,其出愈率相对较高。当2,4-D浓度为1.5mg/L时,出愈率最高,达到37%。试验中发现,4种培养基中各外植体的出愈速度和愈伤组织的生长速度都很慢,增长也不明显,①号培养基用芽体做外植体时最早出现愈伤组织(接种后第10d),②号配方的茎尖,在第20d初见愈伤组织;③号配方茎段和芽体均在第23d左右初见愈伤组织;④号配方的芽体初见愈伤组织的时间最迟(接种后第26d),但该配方上愈伤组织最好,黄白色,颗粒大而疏松(表2)。2.2外植体的诱导结果将3种外植体分别接入A、B、C培养基上,4d后茎尖和茎段的基部在3种培养基中个别外植体有生长点出现,茎段的生长点的膨大速度较快,15d后出现绿色芽体;11d左右茎尖出现明显的芽体。30d时的诱导结果见表3。表3显示,当BA浓度一定时,外植体对出芽率的影响表现为:茎尖最高(分别为12%、50%、62%)茎段次之,块茎最低;当采用同种外植体时,不同激素组合对芽分化的影响表现为:处理C效果最好(最高可达62%),B次之,A最差。试验表明,采用NAA0.2+BA0.3的激素组合,有利于马铃薯芽的分化。在此激素水平下,采用茎尖作外植体,其芽的分化率高达62%。因此,本研究的3种培养基中,MS+NAA0.2+BA0.3是最适合诱导马铃薯不定芽的培养基配方,茎尖是诱导不定芽的最适外植体。2.3丛生芽总个数d单芽接种到继代培养基中第10d即可看见长出的不定芽,16d时丛生芽平均个数为5个,30d时丛生芽平均个数增加到8个。芽高保持在0.3～4.8cm之间。不定芽细长,着生于叶腋处。2.4生根培养将诱导出的不定芽,接入诱导生根的培养基后15d,小苗基部表面都出现淡黄白色突起,20d后逐渐长成细长的白色单根。3外植体作诱导研究中发现,用马铃薯的3种外植体进行愈伤组织诱导时,出愈率普遍偏低,但大部分材料在其底端都以较快的速度长出了大量的不定根。这可能是由于NAA的促根作用和使用浓度偏高;也可能是由于接种时将外植体基部插入培养基中,抑制了愈伤组织的生长,促进了根的形成。研究中还发现,当以茎段作外植体进行芽的诱导时,3种不同培养基都能使茎段底部出现致“瘤”现象,而凡是出现“瘤”的外植体,接入培养基后50d后,均仍无出芽迹象;当用茎尖诱导不定芽时,出芽率虽然最高(62%),但诱导出的不定芽白化现象严重,生长受到一定程度的限制。当用升汞对块茎进行表面灭菌时,5min