番茄组织培养的遗传转化及功能基因组学研究

番茄组织培养的遗传转化及功能基因组学研究

番茄是世界上重要的耕作植物，在植物生物学研究领域也发挥着重要作用。首先,由于番茄基因组较小、遗传背景较清楚、易于遗传转化,番茄成为茄科模式植物;其次,番茄具有拟南芥、烟草和水稻等模式植物所不具备的果实成熟现象,因此番茄还是果实发育生物学研究的模式植物。番茄基因组测序工作已于2005年开始,已经测定的序列公布在/organism/1/genome(贺俊等,2008)。2011年5月11日,深圳华大基因研究院与荷兰共同启动了“100个番茄基因组研究计划”。番茄功能基因组学研究的大幕正在拉开。对于功能基因组学和分子生物学研究,遗传转化是必不可少的试验技术。目前番茄转化的主要方法是结合组织培养的农杆菌介导法,因此建立简便、高效的番茄再生体系,是深入开展番茄生物学研究的重要基础。本文从培养条件、外植体选择、再生中的组织形态学变化、体细胞变异等方面,综述了番茄离体再生的研究进展。1影响番茄离子再生的主要因素1.1国内番茄栽培品种现状番茄离体再生具有基因型依赖性(Matzke&Matzke,1998;El-Bakry,2002;Elluletal.,2003)。国内生产上番茄的栽培品种很多,已经有部分品种成功进行了组织培养,比如中蔬(鲜丰)系列、丽春、樱桃番茄等。Micro-Tom是近年来番茄研究中广泛使用的试材。它是一种番茄突变体,保留了普通番茄作为模式植物的基本特征,但植株矮小、生命周期较短、可以高密度种植。因此,已被广泛应用于番茄功能基因组学的研究(Meissneretal.,1997)。1.2不同品种番茄的再生频率番茄组织培养中使用的外植体种类很多,有花药、叶片、原生质体、子叶和下胚轴,其中用的最多的是子叶。不同品种、不同外植体的再生频率各不相同。El-Bakry(2002)用含有不同浓度的6-苄基腺嘌呤(6-BA)和3-吲哚乙酸(IAA)的MS培养基,对10个不同番茄品种子叶的再生频率进行了观察。当6-BA和IAA的浓度为4.0mg·L-1和0.2mg·L-1时,5个品种的诱导率可达100%,Supermarmande诱导率最低,只有66.7%。1.3不同的生物酶学研究番茄组织培养通常使用MS培养基,从表1可以看出,玉米素(ZT)是使用较多的细胞分裂素。与人工合成的细胞分裂素6-BA相比,ZT诱导番茄再生的效率更高。以中蔬6号的离体再生为例,ZT和IAA组合的出芽率、正常芽率和增殖系数明显高于6-BA与IAA的组合(于明礼等,2006)。陈丽萍等(2007)的研究也发现细胞分裂素ZT的不定芽诱导效果明显优于6-BA和激动素(KT),KT诱导效果最差,生长素IAA的不定芽诱导效果优于吲哚丁酸(IBA)和萘乙酸(NAA)。植物的组织培养通常需要细胞分裂素和生长素配合使用,但曹慧颖和郭三堆(2005)、Sun等(2006)、Ehlert等(2008)、曹慧颖等(2009)在番茄再生诱导中仅使用了ZT,可见ZT对于番茄组织培养具有重要作用。1.4光周期对番茄再生的影响光对外植体的生长、分化具有重要影响。一般说来,黄化苗提供的外植体很难实现较好的再生(Bertram&Lercari,2000),白光比红光或绿光更适于番茄组织培养(Schuetze&Wieczorrek,1987)。多数番茄组织培养试验使用日光照16h的光周期,Bhatia和Ashwath(2005)系统研究了光周期对番茄再生的影响,结果表明光周期对番茄再生没有显著影响,最大芽再生率出现在日光照16h(60%),24h光照和24h黑暗条件下芽诱导率分别是40%和47%。而且Gresshoff和Doy(1972)发现番茄花药培养中,不管光照条件如何,只要提供适当的培养基,花药形成的愈伤组织都能分化。培养温度也会影响番茄再生。番茄组织培养的常用温度是25℃。当温度不能控制在最适条件时,较低的温度(19℃)比较高的温度(28℃)更能促进茎外植体的再生(Reynoldsetal.,1982)。1.5最佳激素的测定番茄通过器官再生方式生成的不定芽,还需要生根变成完整的植株。多数关于番茄再生的文献都研究了生根的最佳激素条件,一般使用浓度为0.05~0.5mg·L-1的生长素,发根率可达100%。陈火英等(2000)用不同浓度NAA、IAA、IBA、二氯苯氧乙酸(2,4-D)进行生根培养试验,发现番茄的内源生长素浓度较高,添加生长素对不定芽发根有一定的作用,若不添加生长素也极易发根。2织化、扦插及细胞胚再生番茄的离体再生可通过器官发生和体细胞胚两条途径实现。已经报道的番茄再生体系多数都是器官发生,即首先从外植体上诱导愈伤组织,然后由愈伤组织分化不定芽,再将不定芽从基部切断,扦插生根。陈火英等(2001)对鲜丰番茄离体培养中有关细胞启动、分裂、分化以及器官发生做了细胞组织学观察,发现不定芽通常发生在愈伤组织的周边区,也可起源于维管组织结节周围,形成层状细胞。体细胞胚再生途径是类似于合子胚发育的途径。关正君等(2011)以樱桃番茄为试材建立了体细胞胚再生途径,显微观察发现,体细胞胚发生不同步,但也经历了球形胚、心形胚、鱼雷胚、子叶胚等阶段。3细胞基因突变鉴定体细胞无性系变异是植物组织培养过程中的普遍现象,这些变异不一定都产生表型变化,但是可以从分子水平上鉴定。Nambisan等(1992)检测了超过950株番茄再生植株,没有发现标记位点表型变化;但是用叶绿素a/b结合蛋白cDNA序列杂交,17个检测样本中有2个出现了多态性。分子标记技术是广泛应用的体细胞无性系变异鉴定方法。Soniya等(2001)利用RAPD技术检测番茄再生苗,得到了15条非亲本条带,说明这些样本发生了体细胞变异。李继红等(1999)利用RAPD技术在60个随机引物中找到了4个可用于鉴定4个番茄品种体细胞无性系变异的引物。Bhatia等(2005)建立了番茄体细胞变异的AFLP检测方法。虽然体细胞变异影响再生植株的遗传稳定性,但另一方面也可为育种开辟一条新途径。Cano等(1996)、Rus等(2000)以NaCl作为选择压力,结合离体再生筛选出了番茄耐盐突变体。4对番茄组织培养的研究作为一种重要的蔬菜作物,目前关于番茄组织培养的研究报道较多。番茄的组织培养相对比较容易,已经建立了许多器官发生途径及部分体细胞胚再生途径,但是深入的组织形态学研究较少,很多再生途径不能确定再生细胞来源以及是否由单细胞发育而来。另外番茄组织培养的繁殖系数也有待提高。鉴于此,对于番茄组织培养,今后应加强以下两个方面的研究:(1)建立单细胞来源的体细胞胚再生途径。番茄组织培养是遗传转化和功能基因组学研究的重要基础,对于单细胞来源的再生植株,不产生