新月叶片组织培养的影响因素

新月叶片组织培养的影响因素

月月也是著名的春、瘦客、春花、四季红和月月红。它来自中国，是蔷薇科和蔷薇科的植物。月季为半常绿灌木,花朵俏丽,色彩丰富,被誉为“花中皇后”。月季花能吸收硫化氢、氟化氢、苯、苯酚等有害气体,同时对二氧化硫、二氧化氮等有较强的抵抗能力,因此月季花是保护和美化人类生活环境的良好花木。目前我国月季有上千个品种,但由于其繁殖以扦插繁殖为主,繁殖速度慢,满足不了生产发展的需要,而组织培养可在短期内获得大量的优良种苗,为此,我们撰写了这篇文章,期望能够促进月季组培快繁的研究工作。影响月季叶片组织培养成功与否的因素很多,现总结如下。1材料因素的影响1.1选择物种依据对愈伤组织的诱导大量试验证实,组织培养中基因型的依赖性是一种普遍现象。由于基因型的影响,不同月季品种间的组织再生频率不同。任桂芳、王建红、冯慧等选取24个现代月季品种无菌苗的顶生3片叶接种于培养基上,15d时部分品种叶片叶柄砧处开始不规则膨大,20d时可见绿色芽点,40d后形成不定芽,50d时12个品种可见不定芽的分化,且不同品种间的分化率差异很大,为10.9%～46.5%,其余12个品种未见不定芽分化。冰山品种的再生频率最高,为46.5%。林娅、郑玉梅等研究发现,月季不同品种之间愈伤组织诱导率和诱导数量差异显著。“萨曼莎”、“金斯莱克”、“休姆主教”、“宠爱小姐”、“蓝丝带”、“卓越”、“埃菲尔铁塔”7个品种在适宜的培养基上愈伤组织诱导率都能够达到100%;而“樱桃白兰地”和“绿野”的愈伤组织诱导率分别只有60%和50%。此外,愈伤组织诱导的数量也因品种不同而有很大差异,依次是“萨曼莎”、“休姆主教”、“埃菲尔铁塔”愈伤组织直径为3～4mm,“卓越”2～3mm,“金斯莱克”、“宠爱小姐”、“蓝丝带”1～2mm,“樱桃白兰地”、“绿野”4～7个愈伤粒,愈伤粒直径1～2mm。Hsia等报道不同品种、不同外植体在不同NAA浓度上产生不同的效果,‘BabyKatie’的叶片愈伤组织在11,27μmol/LNAA浓度下愈伤组织发生率高,并有根形成,在54,81μmo1/L有3%再生率。“RedSunblaze”叶片愈伤组织在11μmo1/L可达到6.6%的再生率。1.2影响生理状态的影响1.2.1培养材料的选择Chritel等以苹果叶片为试材的比较试验发现,不同来源的苹果叶片其再生能力从大到小的顺序为:试管苗、温室苗、根蘖苗。月季上,朱鹿鸣等对50多个名贵月季品种进行了试管繁殖试验。在几种基本培养基(MS、Wpm、B5等)上均可成功。但以MS较好。不同品种月季在同一分化培养基上,其繁殖系数有较大差异。用液体培养基培养月季小芽其增殖速度比固体快,且小苗生长粗壮,但其培养方法有待进一步完善。诱导根原基的培养基为MS+NAA0.5mg/L或MS+IBA1.0mg/L。具有根原基的试管苗移栽成活率高,移栽速度快,可脱离培养基远距离运输,故用具有根原基试管苗比用根系已长出的试管苗有较大的优越性。1.2.2愈伤组织的观察高莉萍、包满珠用小叶和复叶柄作外植体在诱导培养基上黑暗培养8d后,切口处不同程度地膨大,以小叶外植体膨大更为明显,未见明显的愈伤组织。小叶中幼嫩、体积大并具有较长小叶柄者,小叶柄基部膨大程度最高,肉眼可见白色突起,是已分化的不定芽。切口膨大并已形成白色突起的外植体转入发枝培养基进行光下培养后,突起很快变绿,抽出叶片并发育成枝条小叶外植体和复叶柄外植体的再生存在显著性差异,2次重复试验共60片小叶和40个复叶柄,其中51.8%的小叶和10%的复叶柄再生不定芽,平均每个外植体分化1.3和1个不定芽。1.2.3叶片外植体再生任桂芳、王建红、冯慧等将金秀娃、冰山和火球3个月季品种无菌苗的不同部位叶片(顶生3片叶、中部叶片和基部叶片)接种于培养基上。结果表明顶部叶片的分化率最高,中部叶片次之,下部老叶片未见分化。高莉萍、包满珠做了2次重复共试验了49个三位叶和46个五位叶,平均有30.7%的三位叶和53.9%五位叶再生不定芽,每小叶再生1～2个不定芽。虽然五位叶的再生率高于三位叶,但它们之间并没有显著性差异。而且他们发现叶位对再生的影响不大,只要是幼嫩的未展开的小叶都能有效再生植株。因此,采用小叶外植体进行遗传转化时,材料的选取不必受到叶片位置的限制,材料来源更加丰富。Dubois等报道的两步直接再生不定芽的方法是目前所报道再生率最高,需时最短的再生方法。他们首先将采自田间未展开的幼嫩复叶消毒后切成带柄的小叶,此小叶在诱导培养基(1/2MS+1.5mg/LTDZ(噻重氮苯基脲)+0.05mg/LNAA+100mg/LCH(水解酪蛋白)+10mg/LAgNO3)上黑暗下诱导8天,然后.转入发枝培养基(MS+0.5mg/LBA+0.01mg/LNAA+0.1mg/LGA3)中不定芽长成植株。所试24个品种25天后不定芽的再生率为65%～100%(其中15个品种再生效果非常好,5种较好,4种中等)。再生率越高的品种,再生所需时间越短,不定芽生长越快,且再生芽数也越多,并且田间苗较组培苗的效果好。张常青、洪波、王海琴等在叶柄再生芽的诱导中发现,经一定黑暗条件的诱导培养和光周期再生培养,不定芽再生可以同时通过愈伤组织发生和器官直接发生得到。叶柄外植体在添加7μmol/LTDZ的诱导培养基中暗培养10d,再转接到MS添加0.5mol/L6-BA的再生培养基中16h/8h光周期培养,可以获得57.1%的芽再生率。2-ba和naa、2,4-d的ms培养基的使用效果刘军、丰震、赵兰勇等研究发现,添加了生长素2,4-D的培养基比只有6-BA和NAA两种激素的组合的其叶片愈伤组织诱导率要高,并且愈伤组织也比后者的大。2,4-D与细胞分裂素6-BA共同作用的效果明显好于单独使用的效果。对于品种来说,金徽章的愈伤组织诱导率明显高于婚礼白。Rout等以Landora材料,在添加6-BA和NAA,2,4-D的MS培养基上,外植体叶在接种的7～12d后,在近轴面的叶柄和中脉处产生愈伤,愈伤组织诱导频率高达92%。Hsia和Korban及Li等将品种R.hybrida‘CarefreeBeauty’的叶和节间在含2,4-D,或NAA的培养基上诱导愈伤组织,结果愈伤组织上分化出不少不定根,此带根愈伤组织在含TDZ和GA3的培养基上分化出不定芽,再生率最高可达到53%。3激素浓度对运用短工酶诱导愈伤组织的影响在植物组织培养中,外植体愈伤组织的形成与外源激素的作用密不可分,多种激素的综合使用时,其组合比例、浓度是组培成功最基本的条件。刘军、丰震、赵兰勇等研究表明,生长素2,4-D和细胞分裂素混合使用要比其它组合效果更好。他们经过2个多月的培养,M4培养基(MS+6-BA0.2mg/L+2,4-D2mg/L+活性炭0.3g/L)上叶片愈伤组织生长正常,增殖快,呈黄绿色,该培养基是诱导叶片愈伤组织的最佳培养基。林娅、郑玉梅等通过试验得出结论:在愈伤组织诱导时,NAA是适宜的生长素;它与KT或ZT配合,能够诱导出比较理想的愈伤组织。细胞分裂素BA、KT、ZT和生长素NAA、2,4-D6种激素中,KT或ZT与NAA组合能够较好地诱导月季愈伤组织。试验选择了含有不同浓度KT和NAA以及ZT和NAA两组培养基试验不同激素浓度对月季愈伤组织诱导的影响,结果表明激素浓度主要影响愈伤组织的颜色和质地;一般生长素浓度越高,愈伤组织颜色偏向于黄色,质地也越松散;但是有些品种当生长素达到一定浓度时,会发生不定根;并且不同品种适宜的激素浓度不同。愈伤组织形成后在原培养基中继续培养或转接于含有不同浓度ZT和NAA以及含有TDZ、NAA和GA的两组愈伤组织分化培养基中,结果表明,在愈伤组织分化过程中,生长素仍然是必要的;GA对愈伤组织增殖具有负作用。高莉萍、包满珠研究发现适合田间苗叶片分化不定芽的培养基较适合组培苗叶片分化不定芽的培养基对萨蔓莎小叶外植体不定芽的诱导更为有效,前者小叶不定芽的最高诱导率为51.8%,平均诱导率为39.4%,而后者的分别为44.4%和24.1%。在发枝培养基中,当BA浓度为0.5mg/L或1.0mg/L时,生长素使用NAA比使用等浓度的IBA效果好。生长素浓度为0.01mg/L时,不定芽诱导率高于生长素浓度为0.05mg/L时的诱导率,生长素浓度升高,可促进愈伤组织生长,但不利于不定芽的分化。他们还发现各植物生长调节剂组合中,经诱导适合田间苗叶片分化的培养基黑暗诱导8d后转入含0.5mg/LBA和0.01mg/LNAA的发枝培养基培养的方法更适合月季品种萨蔓莎小叶的直接再生,不定芽诱导率为51.8%,平均每叶再生1.4个不定芽。在其它激素组合中,平均每叶再生不定芽数为1.0～2.4。4活性培养基的添加水解乳蛋白是一种复合有机添加物,马纯艳、贾景明比较培养基的成分时发现,加了水解乳蛋白的培养基比没有添加此物质的培养基,其外植体周边变黑程度得以改善,保持活性时间后者的长,愈伤组织比较大,且诱导率也高于后者,所以,他们认为水解乳蛋白中可能有某种有机营养物质是玫瑰叶培养中必不可少的,为外植体生长提供足够的必须的营养,使其保持旺盛的生命力。5叶片外植体的诱导、分离和再生林娅、郑玉梅、刘青林研究发现,在暗培养条件下,“萨蔓莎”、“休姆主教”、“宠爱小姐”、“卓越”、“埃菲尔铁塔”叶片外植体的愈伤组织诱导率、愈伤组织数量与在光培养条件下诱导的没有差异。但是愈伤组织色泽较暗,没有绿色成分,质地也更松散。愈伤组织在相同培养基上继代暗培养。4周后,“萨蔓莎”愈伤组织在MS+KT0.5mg/L+NAA2.0mg/L培养基上分化出绿色芽体。高莉萍、包满珠将小叶外植体在诱导培养基上进行暗培养,然后转入发枝培养基。他们发现,黑暗培养8d对叶片不定芽的诱导最有效,再生率为33.3%,每叶再生的芽数为1.4。而且延长暗培养时间有利于小叶柄基部生长淡黄色愈伤,不利于不定芽的分化及发育,因而再生率下降。张常青、洪波、王海琴等在叶柄再生芽的诱导中发现,经一定黑暗条件的诱导培养和光周期再生培养,不定芽再生可以同时通过愈伤组织发生和器官直接发生得到。叶柄外植体在MS添加7μmol/LTDZ的诱导培养基中暗培养10d,再转接到MS添加0.5mg/L6-BA的再生培养基中16h/8h光周期培养,可以获得57.1%的芽再生率。任桂芳、王建红、冯慧等分别取金秀娃、冰山和火球无菌苗的顶生3片叶分别接种于培养基上进行暗培养试验。结果表明暗培养30d对月季叶片的分化最为有利,冰山暗培养30d后分化率比无暗培养提高了30.9%。6不同材料对褐化的影响在月季叶片愈伤组织诱导过程中,褐化的发生比较严重。为降低褐化率,刘军、丰震、赵兰勇等认为首先要选择适宜的外植体。所选材料的年龄、取材部位、材料的大小及外植体受