0627 环氧乙烷残留量气相色谱法分析课件

技术中心实验室2018.06环氧乙烷残留量分析方法0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析2环氧乙烷1345气相色谱的基本概念气相色谱的结构EO的测试气相色谱的维护6其他测试0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析理化性质：

最简单的环醚无色气体沸点：10.4℃

易爆，易挥发，有醚味。

1.1环氧乙烷的综述环氧乙烷对人体的危害（1）急、慢性毒性（2）三致作用及生殖毒性（3）急性中毒与局部刺激（4）神经系统损害与慢性毒性（5）致癌作用（6）生殖毒性灭菌：EO具有顽强的扩散和穿透能力，对细菌芽孢、真菌和病毒等各种微生物均有灭杀作用，属于广谱灭菌剂。机理：烷基化反应0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析1.1环氧乙烷的综述残留物：1.EOEthyleneOxide环氧乙烷2.ECHethylenechlorohydrin氯乙醇3.EGEthyleneGlycol乙二醇★

一种刺激体表、具有急性毒性，并且在中毒剂量通过皮肤快速吸收的易燃性液体。★

轻微的致突变性，具有产生胎儿毒性的潜能。

★动物致癌试验：阴性ISO10993-7:2008附录I★

EG无遗传毒性，未显示任何潜在的致癌性★多数材料中EO转化为EG不明显，且EG允许限量明显高于EO、ECH

★棉花、胶原0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析

参照标准：ISO10993-7:2008器械分类EOECH短期接触（≤24h）4mg9mg长期接触（≥24h，≤30d）60mg/30d60mg/30d持久接触类（≥30d）一生2.5g一生10g表面接触器械和植入器械的可耐受接触限量（TCL）10μg/cm2或极轻微刺激5μg/cm2或极轻微刺激人工晶状体0.5μg/d4xEO建议限量血细胞分离器（单采）10mg22mg血液氧合器60mg45mg心肺旁路装置20mg9mg血液透析器4.6mg4.6mg接触完好皮肤的手术单10μg/cm2或极轻微刺激5mg/cm2或极轻微刺激医疗器械环氧乙烷的接触量限度1.2环氧乙烷限量0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析1.3环氧乙烷分析方法比色分析法

环氧乙烷在酸性条件下水解生成乙二醇，乙二醇经高碘酸氧化生成甲醛，甲醛与品红－亚硫酸试液反应生成产生紫红色化合物，通过比色分析法可求得环氧乙烷含量。气相色谱法在一定温度下，用萃取剂萃取样品中所含环氧乙烷（EO），用顶空气相色谱法测定环氧乙烷含量。0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析

1.4环氧乙烷-浸提方法浸提方法模拟使用浸提极限浸提定义：用水浸提来模拟产品使用，通过评价患者或使用者在日常使用器械中所接触到的残留物水平。a)浸提介质：水b)浸提温度：整个或部分与人体接触的器械在37℃浸提，不直接与人体接触的器械在（25±2）℃浸提；c)浸提时间：应考虑在推荐或预期使用最为严格的时间条件下进行，但不短于1h；d)浸渍表面：器械与药液或血液接触的表面。短期接触长期接触定义：随后的浸提至浸提液中EO或ECH的量小于首次浸提液中10%检出量的浸提，或浸提到测得的累积残留量无显著性增加。持久接触包括热极限浸提法和溶剂极限浸提法0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析通过分析有代表性的“最坏情况”，经动力学研究来掌握一族相似的产品。1.5影响环氧乙烷残留量的因素温度、装载密度和排列、气流、时间因素材料组成涤纶、聚碳酸酯吸附量大包装材料、包装密度、运输容器的密度浓度、作用时间、温度、循环类型、湿度、抽真空度与换气次数、产品密度。。通风灭菌循环包装组合包：选择残留量最大的作为代表如：导管、纱布、吸液材料、手术衣袖口0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析1.5影响环氧乙烷残留量的因素组合包：手术衣袖口0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析分配系数

在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（g/mL）比，用K表示分配比k：质量比，又叫容量因子或容量比分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化。分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。2.1色谱的基本概念-分配系数0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析2.1色谱的基本概念-分配系数分配比与分配系数的关系

式中β为相比，流动相体积Vm与固定相体积VS之比分配比k与保留时间tR的关系－k的实验求解0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析2.2色谱的基本概念1.基线

无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。2.保留值：时间或体积

保留时间（tR）：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间；死时间（tM）：不与固定相作用的气体（如空气）的保留时间调整保留时间（tR

＇）：tR＇=tR－tM

0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析2.2色谱的基本概念3.相对保留值r21组分2与组分1调整保留值之比：

r21=t´R2

/t´R1=V´R2/V´R1相对保留值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。

r21=t´R2

/t´R1=K2/K1＝k1/k20627环氧乙烷残留量气相色谱法分析2.2色谱的基本概念色谱峰为高斯正态分布时，色谱流出曲线为：

用来衡量色谱峰区域宽度的参数，有三种表示方法：（1）标准偏差(

)：即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。（2）半峰宽(Y1/2)：色谱峰高一半处的宽度Y1/2=2.354

（3）峰底宽(Y)：Y=4

色谱柱效参数0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析2.3色谱的基本概念-理论两种色谱理论塔板理论——热力学因素速率理论——动力学因素

塔板理论的假设：(1)在每一个塔板上，可以迅速建立分配平衡(2)将流动相看作成脉动（间歇）过程；(3)试样沿色谱柱方向的扩散可忽略(4)每次分配的分配系数相同。0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析2.3色谱的基本概念-塔板理论

色谱柱长：L，塔板高度：H，色谱柱的理论塔板数：n，则三者的关系为：

n=L/H

理论塔板数与色谱参数之间的关系为：组分在tM时间内不参与柱内分配，需引入有效塔板数和有效塔板高度：Y柱效参数：

单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高Y0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析2.3色谱的基本概念-塔板理论(1)提出了计算和评价色谱柱效的参数和方法

(2)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。(3)无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。塔板理论的特点和不足0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析2.4色谱的基本概念-速率理论用速率方程重新定义塔板高度，并提出影响柱效的动力学因素：涡流扩散、分子扩散、传质阻力速率方程（也称范.弟姆特方程式）

H=A+B/u+C·u

H：理论塔板高度，u：载气的线速度(cm/s)A

涡流扩散项

B/u分子扩散项

Cu

传质阻力项2023/10/100627环氧乙烷残留量气相色谱法分析2.4色谱的基本概念-速率理论涡流扩散项

A=2λdp

dp：固定相的平均颗粒直径λ：固定相的填充不均匀因子固定相颗粒越小dp↓，填充的越均匀，A↓，H↓，柱效n↑，色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析2.4色谱的基本概念-速率理论分子扩散项

B=2νDgν

：弯曲因子，Dg：组分在气相中的扩散系数（cm2·s-1）

与组分性质、流速、滞留时间、流动相性质、柱温等因素有关0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析传质阻力项2.4色谱的基本概念-速率理论

k为容量因子；Dg、DL为扩散系数。

减小担体粒度，选择小分子量的气体作载气，可降低传质阻力。流动相传质阻力Cg固定传质阻力CL

C=（Cg+CL）0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析2.5色谱的基本概念-分离度

塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响：保留值之差──色谱过程的热力学因素；

区域宽度──色谱过程的动力学因素。色谱分离中的四种情况如图所示：①柱效高，△K(分配系数)较大,完全分离；②△K不是很大，峰较窄，柱效高，基本分离③峰宽，柱效较低，△K较大,但分离的不好；④△K小，柱效低，分离效果更差。0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析2.5色谱的基本概念-分离度分离度的表达式：R=0.8：两峰的分离程度可达89%；R=1：分离程度98%；R=1.5：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析2.5色谱的基本概念-分离度影响分离度的因素：22114kknR+·-·=aa理论塔板数n

增加柱效，可提高分离度

r21

（或α选择因子）

增大r21是提高分离度的最有效方法，容量因子，分配比柱选择项柱容量项柱效项0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析2.5色谱的基本概念-分离度k影响峰位n影响峰宽窄α影响两峰间距0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析2.6色谱的基本概念-分离条件的优化载气及其流速

H=A+B/u+C·u，

最佳流速uopt

＝(B/C)1/2柱温

柱温↓，分离度↑，分析时间↑，综合考虑

复杂，沸程宽的试样，采用程序升温

柱长和柱内径

满足分离目的的前提下，尽可能选用较短的柱载体

粒度影响柱效

进样方式和进样量0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析2.7色谱的基本概念用回收率表示，至少3个浓度点9个结果。术语检出限一般认为：色谱图上平直基线部分的噪声峰高RN，3倍RN对应的量就是检出限。基线漂移在最初基线的5%以内至少5个浓度点，最小相关性宜为0.95（ISO10993-2008）要求0.99以上。准确度相关性基线0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析3.1气相色谱-结构

气相色谱法系采用气体为流动相（载气）流经装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。物质或其衍生物气化后，被载气带入色谱柱进行分离，各组分先后进入检测器，用记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。

采用溶液直接进样时，进样口温度应高于柱温30℃~50℃柱温箱稳定性要求:±1℃，波动0.1℃/h火焰离子化检测器（FID）：痕量有机物热导检测器（TCD）：水、气体混合物的分析电子捕获检测器（ECD）：含卤素的化合物NPD、FPD、MS检测器温度一般应高于柱温，并不低于150℃，以免水汽凝结，通常为250~350℃。色谱柱:填充柱或毛细管柱。（230℃老化5h）载气系统包括气源、气体净化、气体流速控和测量5个9隔垫衬管0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析3.2气相色谱-操作毛细管进样系统：InertCap6240.32mmx30mx3.00μm上海舜宇GC11200627环氧乙烷残留量气相色谱法分析4.1气相色谱法-定量法定量法

归一法适用于试样中各组分都能流出色谱柱，并在色谱图上显示色谱峰。全部出峰外标法精密量取对照品，配制成溶液，注入仪器，记录色谱图对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积（或峰高），按下式计算含量：Cx=CR×Ax/AR自动进样内标法精密取对照品和内标物质，分别配制成溶液，精密取各溶液配成校正因子测定的对照溶液，测量对照品和内标物质的峰面积或者峰高，按下式计算校正因子：（f）=As×CR/AR×Cs再取各项中含有内标物质的供试品溶液，测量峰面积。按下式计算含量：Cx=f×Ax×C′s/A′s例子：EO、ECH例子：乙醇（正丙醇）甲醇（正丁醇）EO（氧化丙烯）内标物4个注意点：⑴相近相似；⑵试样中不存在内标物，且完全分离；⑶纯物质或已知含量；⑷互溶，不可逆不能全部出峰0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析标准贮备液测试样品绘标准曲线参考标准：ISO10993-7-2008、GB/T14233.1-20084.2EO的测试计算结果0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析4.3标准曲线-EO1、标准储备液的配制取外部干燥的50mL容量瓶，加入30mL水，称重，记a；用冷却的注射器加入0.2mL环氧乙烷，轻轻摇晃后，盖好瓶盖，称重，记b。前后质量差即为溶液中所含环氧乙烷的质量，加水至刻度线，配成储备液，该浓度为C1=（b-a）*CEO*103/50mg/mL。2、稀释10倍为C2后配置成标样点3、加热每个标样取5mL液体，于60℃下加入40min4、测试并绘标准曲线5、举例a=61.6839gb=61.8183gC1=(61.8183-61.6839)x99.5%x103/50=2.67456mg/mL=2674.56μg/mL稀释10倍，C2=267.456μg/mL取8个100mL容量瓶，配置标样点：0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析4.4标准曲线-EO0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析4.4测试样品1、制样将样品透析包装打开，选取易于拆卸、剪取及不易环氧乙烷解析部位，将样品剪成5mm碎块，取1.00g，置于20mL顶空瓶，加水5.0mL，密封。注意：a、做好准备工作b、组合包中每款产品都检，以“结果最坏的”作为组合包的测试结果c、稀释合适的倍数2、加热

样品于60℃下浸提40min（极限浸提法）3、测试4、记录导入校准表，查看结果热极限浸提法0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析绝对含量WEO=5cm1/m×10-3（mg）

m1-单位产品质量；m–称样量

相对含量CEO=5c/m（μg/g）

4.4测试样品0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析4.4样品的处理1、样品的保存注：验证时，“空白样品”0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析4.4样品的处理2、顶空瓶的处理

测试完的顶空瓶，剪开瓶盖，倒出样品，在自来水下冲洗后，放在盆中，加入肥皂水，于通风橱下浸泡1-2天；捞出清洗干净，在120℃下干燥2-3h。注：验证时，“空白样品”0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析五、气相色谱-维护a、新的柱子主要目的：去除键和不够稳定的固定相，让新柱子性能更稳定。b、多次测试的柱子或测了残留大样品的柱子主要目的：去残留

T老化=（T方法Max+T耐受Max）/2老化的第一个重点：老化的最高温度

极性强、膜厚大的柱子通常耐受温度比较低，老化前，需仔细查阅色谱柱包装盒或说明书。5.1气相色谱-维护-色谱柱的老化0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析5.1气相色谱-维护-色谱柱的老化老化失败最常见的原因a、氧气的存在高温下氧气是破坏化学键的好手，而色谱柱里的固定相一旦破坏，彼此间的键键链会破坏，固定相不能再“稳定”固定在色谱柱中，造成大量柱流失，柱效大幅下降。处理：1、把色谱柱末端伸入溶剂中，观察是否有连续的泡沫（查漏）2、升温前，先通15min氮气3、确保其它接头，正确安装

c、已使用过的柱子先分析样品成分，若是在老化温度下也不能被完全气化的成分，如蛋白质、胶状物，在老化前，应先进行色谱柱的维护换衬管、色谱柱柱头切割b、新柱子老化，最好不接检测器FID检测器：可不连检测器、不点火、不开空气和氢气0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析

5.2气相色谱-维护3.4.1气体FID：氢气为燃气，空气为助燃气纯度填充柱：99.99%氮气作为载体

毛细管分析：99.999%氮气作为载气

氢气：安全原因氦气：灵敏度高，基线噪声非常小，成本过高定期检查去除来自空气压缩机的空气水分的硅胶和除去有机物的分子筛等极性强的毛细管柱耐氧化性差，容易因氧化等而变化，因此，尽量装配氧气捕集器除氧。氧气捕集器须定期用氢还原进行再生。来自空气压缩机的空气不是经常流量一定，流量变动会影响基线，因此，在流路途中增加硅胶管和用于控制流量的波纹管阀，使流量稳定。3.4.2柱柱的使用温度尽量比柱的耐热温度低

除去载气中的氧（特别是使用极性柱时）使用高纯度气体；气瓶更换时不要混入空气氧气捕集器装在GC前不要使难挥发的成分进入柱内充分做好试样的预处理使用柱衬管和石英棉安短的一次性使用的前置柱3.4.3FID检测器柱子老化时，不要把柱子与检测器连接，以免检测器被污染，上海舜宇GC1120的色谱柱最高温度为230℃。各操作温度未平衡之前将氢气及空气源关闭，以防止检测器内积水。点火时，不要使按钮按下时的时间过长，以免损坏点火圈。仪器开机后，应先通过载气再升温，待FID检测器温度超过100℃时方能点火。0627环氧乙烷残留量气相色谱法分析6.1其他-酒精的测试

1.比重法适用于仅含乙醇和水的溶液原理：酒精比重计放入样品溶液中，比重计下按放手，当其上浮静止且溶液无气泡时，读取液面处刻度，即为乙醇含量。3.比色法-紫外-可见分光光度法参考标准：中国药典2015版（第三部）P4623201乙醇残留量测定法原理：乙醇在饱和碳酸钠溶液中加热逸出，被重铬酸钾-硫酸溶液吸收后呈黄绿色至绿色，用比色法测定血液制品中乙醇残留量。波长650nm4.气相色谱法（毛细管柱法加校正因子内标法）参考标准：中国药典2010版附录ⅨM；GB26373-2010乙醇消毒剂卫生标准