微生物学课件：第07章 遗传变异和育种修改稿

第7章微生物的遗传变异和育种遗传：亲代与子代相似变异：亲代与子代、子代间不同个体不完全相同遗传（inheritance）和变异（variation）是生命的最本质特性之一遗传型：表型（表现型）：生物的全部遗传因子及基因具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的形态等生物学特征的总和。表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。表型饰变：表型的差异只与环境有关特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为橘生淮南则为橘，生于淮北则为枳。遗传型变异（基因变异、基因突变）：遗传物质改变，导致表型改变特点：遗传性、群体中极少数个体的行为（自发突变频率通常为10-6-10-9）微生物是遗传学研究中的明星：微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系。很多常见微生物都易于人工培养，快速、大量生长繁殖。对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作性强。第一节遗传的物质基础一、DNA作为遗传物质二、RNA作为遗传物质三、朊病毒的发现与思考一、DNA作为遗传物质第一节遗传的物质基础Avery在四十年代以更精密的实验设计重复了以上实验分别用降解DNA、RNA、蛋白质的酶作用于有毒的S型菌细胞抽提物只有DNA被酶降解破坏的抽提物无转化活性DNA是转化所必需的转化因子第一节遗传的物质基础（参见P195）T2噬菌体感染实验（1952年）第一节遗传的物质基础（参见P195）二、RNA作为遗传物质生化提取分别获得含RNA的烟草花叶病毒蛋白质外壳（病毒1）和核酸（病毒2）抗血清处理，证明杂种病毒的蛋白质外壳来自病毒1，而非病毒2杂种病毒的后代的蛋白质外壳表现为病毒2，而非病毒1遗传物质是核酸（RNA）而非蛋白质第一节遗传的物质基础三、朊病毒的发现与思考（参见P191和P195）亚病毒的一种：具有传染性的蛋白质致病因子，迄今为止尚为发现该蛋白内含有核酸。其致病作用是由于动物体内正常的蛋白质PrPc改变折叠状态为PrPsc所致，而这二种蛋白质的一级结构并没有改变。人的库鲁病(kuru)、克雅氏病(Creutzfeldt

Jakobdisease,CJD)等羊搔痒症(scrapie)牛海绵状脑病(spongiformencephalopathy)引起人与动物的致死性中枢神经系统疾病Prusiner(1982)提出羊搔痒病因子是一种蛋白质侵染颗粒（proteinaceousinfectiousparticle），并将之称做Prion或Virino。

-------朊病毒1997年，StanleyB.Prusiner荣获诺贝尔奖第一节遗传的物质基础三、朊病毒的发现与思考1）蛋白质是否可以作为遗传物质？

prion是生命的一个特例？还是仅仅为表达调控的一种形式？2）蛋白质折叠与功能的关系，是否存在折叠密码？DNA→RNA→肽链→蛋白质遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式一、7个水平该部分内容自学二、原核生物的质粒原核生物的质粒质粒的概念：游离于原核生物基因组以外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状的dsDNA分子，即cccDNA。质粒赋予细菌某些对其生存并非必不可少的特殊功能。如：产毒、抗药、产特殊酶、降解有毒化合物等质粒的主要类型高拷贝数(highcopynumber)质粒（每个宿主细胞中可以有10-100个拷贝）

———————松弛型质粒(relaxedplasmid)高拷贝数(highcopynumber)质粒（每个宿主细胞中可以有10-100个拷贝）

———————松弛型质粒(relaxedplasmid)窄宿主范围质粒(narrowhostrangeplasmid)（只能在一种特定的宿主细胞中复制）广宿主范围质粒(broadhostrangeplasmid)（可以在许多种细菌中复制）典型质粒简介F质粒：大肠杆菌等部分细菌内存在，决定其性别并具有转移能力的质粒。R质粒：表现为对抗生素等药物的抗性。Col质粒：细菌素的概念在医疗中具有危害，但可用于微生物筛选和基因工程的标记部分细菌由质粒编码的蛋白质产生的能抑制或杀死其他近源细菌的代谢产物。用于“残害手足”Ti质粒：诱癌质粒，导致植物产生根癌，膨大等现象；用于植物基因工程。月季根癌Ri质粒：发根质粒，诱发大量称为毛状根的不定根。降解性质粒：仅在假单胞菌（Pseudomonas）中发现。具有降解复杂有毒化合物的能力。“超级菌”。隐秘质粒（crypticplasmid）隐秘质粒不显示任何表型效应，它们的存在只有通过物理的方法，例如用凝胶电泳检测细胞抽提液等方法才能发现。它们存在的生物学意义，目前几乎不了解。在应用上，很多隐秘质粒被加以改造作为基因工程的载体（一般加上抗性基因）第二节基因突变和诱变育种基因突变突变类型突变率基因突变的特点基因突变自发性和不对应性的实验证明基因突变及机制紫外线对DNA的损伤及其修复基因突变（genemutation）基因突变的概念：泛指遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化，可自发或诱导产生。野生型菌株（wildtypestrain）：从自然界分离到的菌株。突变株（mutant）：野生型经突变后形成的带有新性状的菌株。基因突变的类型突变株的表型选择性突变株（selectablemutant）非选择性突变株（non－selectablemutant）营养缺陷型抗性突变型条件致死突变型形态突变型抗原突变型产量突变型突变率（mutationrate）细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。某一基因的突变一般是独立发生的，他的突变率不影响其他基因的突变。通常突变发生的几率为10-6～10-9

基因突变的特点1.自发性。2.不对应性细胞可自发的产生突变突变性状与引起突变的原因间无直接对应关系3.稀有性突变几率为10-6～10-9

4.独立性5.可诱变性诱变剂的使用可大大提高突变几率6.稳定性7.可逆性正向突变/回复突变基因突变自发性和不对应性的证明1.Luria等的变量实验（fluctuationtest）2.Newcomb的涂布实验3.Lederberg等的影印平板法（replicaplating）变量实验（fluctuationanalysis）SalvadorLuriaandMaxDelbruck（1943）SalvadorLuriaMaxDelbruckTheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1969Newcombe的涂布实验（1949）影印实验（replicaplating）JoshuaLederbergandEstherLederberg（1952）JoshuaLederbergJ.LederbergisawardedtheNoblePrizeinMedicineandPhysiologyin1958突变真的与选择压力无关吗？适应性突变（adaptivemutability）和高频突变（hypermutation

）BensonS.Adaptivemutation:ageneralphenomenonorspecialcase?Bioessays.1997Jan;19(1):9-11.Review.GalitskiT,RothJR.

Asearchforageneralphenomenonofadaptivemutability.Genetics.1996Jun;143(2):645-59.DanI.Andersson,E.SusanSlechta,andJohnR.RothEvidenceThatGeneAmplificationUnderliesAdaptiveMutabilityoftheBacteriallac

Operon。Science1998November6;282:1133-1135.

GodoyVG,FoxMS.

Transposonstabilityandaroleforconjugationaltransferinadaptivemutability.ProcNatl

Acad

SciUSA.2000Jun20;97(13):7393-8.BullHJ,McKenzieGJ,HastingsPJ,RosenbergSM.Evidencethatstationary-phasehypermutationintheEscherichiacolichromosomeispromotedbyrecombination.Genetics.2000Apr;154(4):1427-37.基因突变及其机制基因突变诱变碱基置换移码突变点突变畸变缺失添加易位、倒位自发突变紫外线对DNA的损伤及其修复UV导致遗传物质产生嘧啶二聚体（TT、TC、CC），造成局部DNA分子无法配对，引起微生物的死亡或突变。一般微生物具有光复活作用。在利用UV进行诱变育种等工作时，应在红光灯下进行照射和后继操作，并放置在黑暗条件下培养。突变与育种一、自发突变与育种（breedingbyspontaneousmutation）1.从生产中育种。仔细观察，做“伯乐”2.定向培育优良菌株。卡介苗（BCGvaccine）：BacillusCalmette-GuerinA.CalmetteC.Guerin诱变育种

（breedingbyinducedmutation）诱变育种是指利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合目的的突变株，以供科学试验和生产实践使用。诱变育种的几个原则1.选择简便有效的诱变剂诱变剂物理诱变剂：化学诱变剂：紫外线、激光、离子束、r－Ray烷化剂、碱基类似物等很多种化学物质，能以各种机制导致DNA的突变a）利用各种诱变剂获得各类遗传突变，进行诱变育种；b）对有害微生物进行控制；c）危害人类自身的健康“生物化学统一性”法则：人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果。诱变剂的共性原则：化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比

超过95%的致癌物质对微生物有诱变作用90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用回复突变(reversemutation或backmutation)：突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变美国加利福尼亚大学的BruceAmes教授于1966年发明，因此称为Ames试验具体操作：检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphmurium)组氨酸营养缺陷型菌株(his-)的回复突变率Ames试验证明Ames试验重要性的应用实例：国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物“反应停”，由于其药效显著，在60-70年代十分流行，但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高，而且生产畸形儿的妇女大多曾服用“反应停”，后来采用Ames试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用，因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行Ames试验检测，那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免，第四节基因突变及修复三、诱变剂与致癌物质——Ames试验（参见P212）由于生物体内、体外可能存在的差异，可在体外加入哺乳动物（如大鼠）微粒体酶系统，使待测物活化，使Ames试验的准确率达80-90%。诱变育种的几个基本原则2.挑选优良的出发菌株依靠经验诱变育种的几个基本原则3.处理单细胞或单孢子悬液诱变育种的细胞应尽量选用单核细胞，丝状菌应选用单孢子。诱变育种的几个基本原则4.选用最适的诱变剂量剂量存活率曲线，剂量右诱变率曲线。诱变育种的几个基本原则5.充分利用复合处理的协同效应诱变育种的几个基本原则6.利用和创造形态、生理与产量间的相关指标利用蛋白酶水解圈、淀粉酶变色圈、纤维素水解圈等诱变育种的几个基本原则7.设计高效筛选方案8.创造新型筛选方法结合具体的目标，大胆尝试，勇于创新。3类突变株的筛选方法1.产量突变株的筛选2.抗药性突变株的筛选梯度平板法定向培育若干代谢产物高产菌株3.营养缺陷型突变株的筛选基本培养基：MMM9medium：Na2HPO412.8gKH2PO43.0gNaCl0.5gNH4Cl0.5g葡萄糖(单独灭菌)10.0g维生素B1(单独灭菌)1μg/ml

pH自然

不能错误的认为基本培养基均是简单的，不含生长因子的。完全培养基：CMPepton(蛋白胨)5gBeefextract(牛肉膏)30g

NaCl5gAgar(琼脂)15g

Distilledwater(蒸馏水)Adjust(调)pHto7.0-7.2

可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。补充培养基：CM例如：在M9培养基中添加L－His等只能满足相应的营养缺陷型突变株生长需要的组合或半组合培养基。3类遗传个体：野生型：MM、CM、SM均能生长营养缺陷型：CM、SM能生长原养型：MM、CM、SM均能生长营养缺陷型的表示方法：基因型：所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示：hisC（组氨酸缺陷型，其中的大写字母C同一表型中不同基因的突变）表型：同上，但第一个字母大写，且不用斜体：HisC在具体使用时多用hisC-和hisC+，分别表示缺陷型和野生型。第三节基因重组和杂交育种一、原核生物的基因重组转化转导接合原生质体融合接合(conjugation)：细胞与细胞的直接接触（由F因子介导）转导(transduction)：由噬菌体介导自然遗传转化(naturalgenetictransformation)：游离DNA分子+感受态细胞一、细菌的接合作用(conjugation)通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程1.实验证据

1946年，JoshuaLederberg

和EdwardL.Taturm细菌的多重营养缺陷型杂交实验（参见P215）中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致！参见P216证实接合过程需要细胞间的直接接触的“U”型管实验（BernardDavis，1950

）参见P2162.机制(大肠杆菌的接合机制)接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导F因子的分子量通常为5×107，上面有编码细菌产生性菌毛（sexpili）及控制接合过程进行的20多个基因。含有F因子的细胞：“雄性”菌株（F+），其细胞表面有性菌毛

不含F因子的细胞：“雌性”菌株（F-），细胞表面没有性菌毛参见P217F因子为附加体质粒既可以脱离染色体在细胞内独立存在，也可插入（整合）到染色体上F因子的四种细胞形式(参见P202)a）F-菌株，不含F因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收

F因子而变成雄性菌株（F+）；b）F+菌株，F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。c）Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。d）F′菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因子。细胞表面同样有性菌毛。1）F+×F-杂交杂交的结果：给体细胞和受体细胞均成为F+细胞理化因子的处理可将F因子消除而使F+菌株变成F-菌株F+菌株的F因子向F-细胞转移，但含F因子的宿主细胞的染色体DNA一般不被转移。（参见P215）Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上，因此只要发生接合转移转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株。2）Hfr

×F-杂交（参见P217）Hfr菌株仍然保持着F+细胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一样与F-细胞进行接合。所不同的是，当OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，F因子的先导区(leadingregion)结合着染色体DNA向受体细胞转移，F因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入受体细胞中，故Hfr×F-杂交后的受体细胞(或接合子)大多数仍然是F-。染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会就越多，在F-中出现重组子的的时间就越早，频率也高。F因子不易转入受体细胞中，故Hfr×F-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是F-。（参见P218）3）F′×F-杂交Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因子。（参见P218）F′×F-与F+×F-的不同：给体的部分染色体基因随F′一起转入受体细胞a）与染色体发生重组；b）继续存在于F′因子上，形成一种部分二倍体；细胞基因的这种转移过程又常称为性导（sexduction）、F因子转导（F-duction），或F因子媒介的转导（F-mediatedtransduction）。Lederbergcoinedthetermplasmidinthe1950stodescribesuchapparentlyextrachromosomalgeneticelements,althoughitdidnotfindwideusageuntilthe1970swheninfectiousdrugresistancebecomeamedicalproblem.二、细菌的转导（transduction）由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式：一个细胞的DNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒DNA带到另一个细菌的噬菌体称为转导噬菌体细菌转导的二种类型：普遍性转导局限性转导（参见P218）1、普遍性转导（generalizedtransduction）噬菌体可以转导给体染色体的任何部分到受体细胞中的转导过程(1)意外的发现1951年，JoshuaLederberg和NortonZinder为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验：用“U”型管进行同样的实验时，在给体和受体细胞不接触的情况下，同样出现原养型细菌！（参见P218）沙门氏菌LT22A是携带P22噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌一个表面看起来的常规研究却导致一个惊奇和十分重要发现的重要例证！基因的传递很可能是由可透过“U”型管滤板的P22噬菌体介导的（普遍性转导这一重要的基因转移途径的发现）（参见P218）(2)转导模型（参见P219）（参见P219）转导噬菌体为什么“错”将宿主的DNA包裹进去?噬菌体的DNA包装酶酶也能识别染色体DNA上类似pac的位点并进行切割，以“headful”的包装机制包装进P22噬菌体外壳，形成只含宿主DNA的转导噬菌体颗粒（假噬菌体）。因为染色体上的pac与P22DNA的pac序列不完全相同，利用效率较低，这种“错装”机率一般仅约10-6-10-8形成转导颗粒的噬菌体可以是温和的也可以是烈性的，但必须具有能偶尔识别宿主DNA的包装机制并在宿主基因组完全降解以前进行包装。普遍性转导的基本要求：（参见P219）普遍性转导的三种后果：进入受体的外源DNA通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子流产转导（abortivetransduction）转导DNA不能进行重组和复制，但其携带的基因可经过转录而得到表达。特点：在选择培养基平板上形成微小菌落外源DNA被降解，转导失败。DNA不能复制，因此群体中仅一个细胞含有DNA，而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。2、局限性转导（specializedtransduction）（参见P219）温和噬菌体感染整合到细菌染色体的特定位点上宿主细胞发生溶源化溶源菌因诱导而发生裂解时，在前噬菌体二侧的少数宿主基因因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体DNA上部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中2、局限性转导（specializedtransduction）温和噬菌体λ裂解时的不正常切割：包含gal或bio基因（几率一般仅有10-6）缺陷噬菌体在宿主细胞内能够象正常的λDNA分子一样进行复制、包装，提供所需要的裂解功能，形成转导颗粒。但没有正常噬菌体的溶源性和增殖能力，感染受体细胞后，通过DNA整合进宿主染色体而形成稳定的转导子。局限性转导与普遍性转导的主要区别：a）被转导的基因共价地与噬菌体DNA连接，与噬菌体DNA一起进行复制、包装以及被导入受体细胞中。而普遍性转导包装的可能全部是宿主菌的基因。b）局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因导入受体，故称为局限性转导。而普遍性转导携带的宿主基因具有随机性。2、局限性转导（specializedtransduction）（参见P219）

溶源转变（lysogenicconversion）：一个与转导相似又不同的现象温和噬菌体感染细胞后使之发生溶源化，因噬菌体的基因整合到宿主染色体上，而使后者获得了新性状的现象。溶源转变与转导的不同？a）不携带任何供体菌的基因；b）这种噬菌体是完整的，而不是缺陷的；三、细菌的遗传转化（genetictransformation）定义：同源或异源的游离DNA分子(质粒和染色体DNA)被自然或人工感受态细胞摄取，并得到表达的水平方向的基因转移过程自然遗传转化（naturalgenetictransformation）人工转化（artificialtransformation）感受态细胞：具有摄取外源DNA能力的细胞（competentcell）自然感受态与人工感受态的不同？自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制；人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内。

（该过程与细菌自身的遗传控制无关！）1、自然遗传转化（简称自然转化）1928年，Griffith发现肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）

的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力进行自然转化，需要二方面必要的条件：建立了感受态的受体细胞外源游离DNA分子枯草芽孢杆菌的自然转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）见P222自然转化过程的特点：a）对核酸酶敏感；c）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化（DNA）

给体菌株和转化受体菌株之间的亲源关系；d）通常情况下质粒的自然转化效率要低得多；提高质粒的自然转化效率的二种方法：1）使质粒形成多聚体，这样进入细胞后重新组合成有活性的质粒的几率大大提高；2）在质粒上插入受体菌染色体的部分片段，或将质粒转化进含有与该质粒具有同源区段的质粒的受体菌-------重组获救b）不需要活的DNA给体细胞；噬菌体DNA被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒转染(transfection)：现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染提纯的噬菌体DNA以转化的（而非感染）途径进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。特点：自然遗传转化的进行涉及到细菌染色体上几十个基因的功能及彼此间的相互协调，因此被认为是名副其实的细菌水平基因转移途径。目前的研究热点：1）细菌为什么要耗费如此多的染色体遗传资源来进行自然转化，即该过程的生物学意义到底何在？它对细菌自身有什么好处？（人们已提出了一些假说，但均不圆满）2）自然转化过程的很多细节仍不清楚，包括细菌如何协调感受态

的建立，外源DNA进入和重组的具体过程等等3）细菌中具有自然转化能力的范围，到底有那些菌具有自然转化能力？4）转化DNA的来源和在自然环境中发生的自然转化接合(conjugation)：细胞与细胞的直接接触（由F因子介导）转导(transduction)：由噬菌体介导自然遗传转化(