八核酸分子杂交

核酸杂交及其他技术第一节核酸分子探针的标记一、探针的定义及类型

核酸分子探针是指用放射性核素或其他标记物标记的、能与特定的靶分子发生特异性相互作用的DNA或RNA片段。

根据来源和性质不同1.基因组DNA探针优点：可来源于克隆化的各种基因，容易获得。缺点：需要避免使用真核生物基因组中存在内含子及非编码序列，否则可能因高度重复序列存在引起非特异性杂交而出现假阳性结果。2.cDNA探针优点：不存在内含子及其它高度重复序列，特异性高。缺点：需要以mRNA为模板，逆转录为cDNA，不易获得，还需注意poly（dT）可产生非特异性杂交。

3.RNA探针优点：稳定性高（RNA/RNA或RNA/DNA）、特异性强（杂交条件更为严格）、效率高（不存在互补双链的竞争性结合）。不存在高度重复序列，非特异性杂交少。杂交后可用RNase将未杂交的探针分子消化掉，从而使本底降低。是一种较为理想的探针。缺点：RNA极易降解，不易操作；有poly（A）尾，有时会影响特异性，但可克服（在杂交液中加入PolyA封闭待测核酸序列中可能存在的PolyT或PolyU）。4.寡核苷酸探针优点：可随心所欲合成需要的探针（大多数为15-30bp)，可用于基因点突变分析（一个碱基不配对也会影响其溶解温度），杂交所需时间短（序列的复杂性降低）。缺点：灵敏度较低（探针所带标记物较少）设计寡核苷酸探针的原则

（根据已知核酸序列）1、探针长度一般要求为10-50bp2、G+C含量应为40-60%3、不应有大于4bp的反向互补配对，避免形成发夹结构4、避免有同一碱基的连续出现5、在计算机上进行同源性比较（大于70%或连续有8个碱基相同时最好不用）二、探针的标记物理想的标记物：敏感度高；特异性强；不影响探针分子的主要理化特性；标记、检测方法简单、探针保存时间长；对环境无污染、对人体无损害；价格低廉。（一）放射性标记物（二）非放射性标记物（一）

放射性标记物

----放射性核素利用放射性核素能产生射线的特性将核素标记在核酸合成所必需的NTP或dNTP上，通过一定方法掺入到DNA或RNA中去制成探针，与待测的核酸杂交后，核素产生的或射线可使底片感光的特性，通过放射自显影的方法进行检测。产生射线的核素：32P、3H、35S产生射线的核素：125I1、常用的放射性核素

（1）32P：产生穿透力强的

射线，放射自显影所需时间短，灵敏度高，是最常用的放射性标记物，但半衰期短（14.3天），射线散射严重。多采用位和位标记dNTP或NTP。（2）35S：射线散射作用弱，分辨率高、半衰期长（87.1天），但释放的

射线穿透力弱，灵敏度低。O(S)O(S)O(S)OH-P-O-P-O-P-O-CH2O硷基O

OOHH(OH)ɑβɣ2、放射性标记物的优缺点优点：灵敏度高：0.01pg特异性强缺点：放射性污染成本高、半衰期短，不能长期保存（二）非放射性标记物1、优缺点优点：无放射性污染成本低、操作简单稳定性好，可长期存放缺点：敏感性、特异性均略低于放射性核素2、常用的标记物

（1）生物素：1-2pg

生物素化核苷酸：bio-16-dUTPbio-11-dUTP生物素化核苷酸----通过酶促反应掺入到DNA中去制成探针----杂交----抗生物素蛋白-生物素-酶的复合物----加底物----显色

光敏生物素：生物素与光敏基团结合----光敏生物素----光敏生物素与核酸探针混合----在强光的作用下----光敏基团与核酸共价结合----生物素标记的探针生物素化的核苷酸和光敏生物素生物素光敏基团（2）地高辛甙元Dig-dUTP----通过酶促反应掺入到DNA中去制成探针----杂交----加抗地高辛-酶的复合物----加底物----显色灵敏度较高：0.1pg特异性较生物素高是较理想的非放射性标记物三、探针的标记方法体内标记法体外标记法化学标记法酶促标记法（一）化学标记法光敏生物素的标记光敏基团在光照下与核酸碱基起交联反应生物素为检测时的标记物生物素-补骨脂（Biotin-psoralen）

补骨脂素是一种光敏物质，与生物素连接成为生物素-补骨脂素。补骨脂素在紫外线照射下与嘧啶碱基发生光化学反应，加入到待标记的DNA中，得到生物素标记核酸探针。可标记ssDNA/dsDNA/RNA/寡核苷酸灵敏度高

（二）酶促标记法缺口翻译法或切口平移法随机引物法末端标记法cDNA探针的标记RNA探针的标记（一）缺口翻译法或切口平移

（nicktranslation）

限量DNA酶I(Mg2+)DNA聚合酶I+32P-dNTP变性32P部分标记的单链DNA片段5‘3‘3‘5‘5’-3’外切酶和5’-3’聚合酶5’3’5’3’5’缺口翻译法的原理限量DNaseI在待标记的双链DNA的每一条链上产生若干个单链缺口。利用E.coliDNA多聚酶I的5’-3’外切酶的活性和5‘-3’多聚酶的活性，在缺口处5’末端每切除一个核苷酸，则在3’末端添加一个核苷酸，以修补缺口。随着缺口在DNA链上的移动，标记的核苷酸就掺入到新合成的DNA链中。缺口翻译法的特点快速、简便、标记的探针均一、特异性高仅适用于较长的双链DNADNA多聚酶必须是E.ColiDNA多聚酶的全酶DNA酶I的浓度一定要适宜（二）随机引物法

（randompriming)

随机寡核苷酸引物（randomprimer）：含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物，可以与任意核苷酸序列杂交，起到聚合酶反应引物的作用。E.coliDNA聚合酶I的Klenow大片段（仅具有5’-3’多聚酶的活性，而无5’-3’外切酶的活性）。5‘3‘3‘双链DNA变性随机引物Klenow大片段32P-dNTP3‘5‘变性随机引物标记法随机引物法标记的原理待标记的双链DNA经变性后与随机引物混合随机引物按碱基互补的原则与模板DNA的相应区域结合DNA多聚酶I的Klenow大片段即从引物3’-OH端开始合成互补DNA链反应中若加入修饰的dNTP即可获得标记的DNA探针随机引物法的特点不但可用于双链DNA的标记，而且可用于单链DNA和RNA的标记操作方便标记率高（三）末端标记法末端脱氧核苷酸转移酶法（terminaldeoxynucleotidetransferase)

5’——DNA——3’OH+-32p-dNTP

5’_______DNA_________3’(pdN)n+nPPi(焦磷酸）

末端转移酶末端脱氧核苷酸转移酶法的特点标记活性高不能控制增加核苷酸的数量（三）末端标记法T4多核苷酸激酶法（methodofT4polynucleotidekinase)3’——————5’OH+32P-P-P-A（ATP）3’————————5’32P+PPAT4多核苷酸激酶T4多核苷酸激酶法的特点可用于单链或双链DNA和RNA样品的5’末端标记。此法极少用于制备核酸分子杂交探针，主要用于核酸序列测定时的末端标记。（四）cDNA探针的标记5’AAAAAA3’5’AAAAAA3’TTTTTT5’AAAAAA3’TTTTTTOligo（dT）反转录酶dNTP（其中一种为32P-dNTP）碱变性SephadexG50柱层析TTTTTT第二节核酸分子杂交技术一、基本原理具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下（适当的温度、离子强度等），按碱基互补的原则，重新形成双链DNA的过程。二、杂交的基本过程

变性

预杂交

杂交洗膜

杂交信号的检测１、变性（Denaturation）热变性：95-100°C,5-10分钟碱变性：0.5Mol/LNaOH,30分钟2、预杂交

目的是用非特异性DNA分子（鲑精DNA或小牛胸腺DNA）及其他高分子化合物（Denharht’s溶液）、脱脂奶粉等将待测核酸分子中的非特异性位点封闭，防止出现非特异性杂交。２、杂交（hybridization)

变性的单链DNA按碱基配对的原则，在适当的条件下重新缔合形成双链的过程。待测DNA样品DNA探针异源DNA双链建立杂交条件需要考虑的因素离子强度:５xSSCDNA浓度:浓度越高,复性速度越快DNA探针长度:探针越长,复性速度越慢杂交温度：杂交反应在低于Tm值15-25

Ｃ温度下进行。一般，探针长500bp，G+C含量为５０％，离子强度为５xSSC；杂交液中不含甲酰胺，Tm值为93.4

Ｃ，杂交温度68.4

Ｃ，含甲酰胺，Tm值为68.4

Ｃ，杂交温度43.4

Ｃ提高杂交效率（硫酸葡聚糖、聚乙二醇等）３、洗膜离子强度：0.1xSCC洗膜温度：低于Tm值5-12

C。探针长500bp，G+C含量42%，离子强度0.1xSSC,不含甲酰胺，Tm值为67

Ｃ，则洗膜温度为55-62

Ｃ.4、杂交信号的检测（1）放射性核素探针的检测：放射自显影（2）非放射性核素探针的检测地高辛标记探针的检测生物素标记探针的检测地高辛标记探针的检测抗地高辛抗体－碱性磷酸酶复合物＋底物（BCIP+NBT)紫色的不溶性化合物生物素标记探针的检测过氧化物酶

＋底物（ＤＡＢ）抗生物素蛋白（卵白素）或链亲和素）生物素棕褐色不溶性的化合物三、杂交的类型液相杂交：固相杂交：膜固相印迹杂交组织细胞原位杂交菌落原位杂交（一）膜固相印迹杂交

1、固相支持物的选择（1）硝酸纤维素膜：在高离子强度下，具有较强的吸附单链DNA和RNA的能力：80-100ug/cm2

优点：杂交本底较低缺点：结合不牢固，质地较脆，在低盐浓度下结合DNA效果不佳，不适用于电转移，对小分子量DNA结合能力不强。（2）尼龙膜：在低离子强度下，很强的吸附单链、双链的DNA或RNA；350-500ug/cm2

优点：结合牢固，韧性强，可用于重复杂交，对小分子量DNA结合能力强，在低盐浓度下可结合DNA，适用于电转移。缺点：杂交本底高

2、膜固相杂交的类型

（1）斑点及狭缝印迹杂交（dotblotandslotblot)：检测DNA或RNA（定性或半定量）（2）Southern印迹杂交(Southern