基因工程 第三章 载体

第三章基因工程载体vectors1.基因工程载体的概念把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫载体。作为基因工程载体，至少应该具备复制的起始区、选择标记基因区、多克隆位点等部分。Tvector的克隆过程AATTTvectorPCRproductT4DNAligaseAA（1）在宿主细胞内能独立复制。（2）有选择性标记。（3）有一段多克隆位点。2.基因工程对载体的要求外源DNA插入其中不影响载体的复制。（4）分子量小，拷贝数多。

3.载体的种类按工作方式:质粒载体、噬菌体载体。按功能:克隆载体和表达载体。按受体细胞:原核细胞（大肠杆菌的克隆载体）和真核细胞的克隆载体。第一节质粒载体一、质粒（plasmid）是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。（1）分子量小：1—200kb（2）编码基因少：2—3个中等大小的蛋白质。（3）环形状：双链环状DNA。（酵母的“杀伤质粒”是RNA）。如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的特性（非必须）。1.质粒的一般生物学特性（4）质粒的空间构型：①共价闭合环状DNA（cccDNA)呈超螺旋（SC）（supercoil）CovalentclosecircularDNA③线形DNA（linear，lDNA）一条链上有一至数个缺口。②开环DNA（opencircular，ocDNA）（5）质粒空间构型与电泳速率同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢。SCOCL二、质粒的类型在大肠杆菌中的质粒，可以分为：接合型质粒（conjugativeplasmid)非接合型质粒（non-conjugativeplasmid)能自我转移不能自我转移除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。如：F质粒（性质粒、或F因子）：又叫自我转移型质粒。1.接合型质粒：不符合基因工程的安全要求。大肠杆菌接合（conjunction）2.非接合型质粒：虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。（1）R质粒（抗性质粒）：带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（resistance）。符合基因工程的安全要求。带有控制大肠杆菌素（colicin）合成的基因。（2）Col质粒：大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。Col质粒或R质粒如果带有转移基因，也可以成为接合型质粒。三、质粒的不相容性(incompatibility,又称质粒的不亲和性)在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定共存，这一现象称为质粒的不相容性,又称质粒的不亲和性。三、质粒的不相容性的分子机制三、质粒载体的构建1.质粒载体的发展概况第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322。第二阶段：增大载体容量(降低载体长度)，建立多克隆位点区和新的遗传标记基因,如pUC系列载体。第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。三、质粒载体的构建2.质粒的命名

用小写字母p代表质粒（plasmid），在p字母后用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称，再加上质粒编号。如：pBR322：p表示一种质粒，而“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F.Bolivar和R.L.Rodriguez，322为编号。分子量大，拷贝数低三、质粒载体的构建3.天然质粒的局限性第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长9.1kb。但只有一个EcoRI切点充当克隆位点，Tetr作为筛选标志。（1）具有复制起点（ORI）4.质粒载体必须具备的基本条件（2）具有抗菌素抗性基因（3）若干限制性内切酶的单一位点：是筛选的标志。理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。用来插入外源DNA片断。且插入后不影响复制功能。（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。抗菌素选择原理活死抗性基因抗菌素四、经典的大肠杆菌质粒载体1.pSC101第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体。（1）类型天然质粒，属低拷贝型。（2）长度9.09kb。（3）选择标记四环素抗性Tetr有Hind、EcoR、BamH、Sal、Xho、Pvu、Sma7种核酸内切限制酶酶切位点，其中在Hind、BamH、Sma3个位点克隆外源DNA，都会导致tetr基因失活。是第一个真核生物的克隆载体。（4）克隆位点pSP2124质粒的Ampr基因2.pBR322：（1）元件来源F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工构建载体。①复制起点oripMB1系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点②

Ampr基因③Tetr基因pSC101的Tetr基因。（2）长度4363bp（3）选择标记氨苄青霉素和四环素抗性。（4）克隆位点其中9个会导致Tetr基因失活（如BamHI、HindⅢ、SalI）；3个会导致Ampr基因失活（ScaI、PvuI、PstI）。24个克隆位点。（5）pBR322的优点①双抗菌素抗性选择标记插入失活，分两次先后选择：没有获得载体的寄主细胞

在Amp或Tet中都死亡。获得载体的寄主细胞

在Amp或Tet其中之一中死亡。外源基因

BamHIAmp中存活但在Tet中死亡外源基因

PstITet中存活但在Amp中死亡3.pUC系列UniversityofCalifornia的J.Messing和J.Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造而成。属正选择载体。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19①复制起点pBR322的ori但其上失去了克隆位点。②

Ampr基因（1）元件来源pBR322的Ampr基因③大肠杆菌β-半乳糖基因（lacZ）的启动子及编码α-肽链的DNA序列，此结构称之为lacZ’基因；

④位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位点（MCS）区段。但它并不破坏该基因的功能。（2）长度约2.7kb（3）克隆位点10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ’基因的5’端。pUC18/19Ampicillin抗性和lacZ的

肽互补（蓝白斑）相结合。（4）选择标记蓝白斑选择原理：①Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-

-D-galactoside）

-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。Xgal半乳糖5-溴-4-氯靛蓝

-半乳糖苷酶②

-半乳糖苷酶Xgal显色反应：③lacZ的

肽互补1）

-肽（lacZ’）：

-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。lacZ只有在4聚体的状态下才有功能.C端大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aa4聚体2）受体菌lacZ突变（lacZ∆M15）受体菌基因组的

-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失

肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解Xgal。受体菌株：JM系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5apUC质粒载体上的lacZ’编码

肽与这个缺失突变的

-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体。又能分解Xgal。产生蓝色物质。C端大部分N端的11-41aapUClacZ’受体菌lacZ∆3）载体lacZ’与

互补4）

互补的插入失活pUC载体上LacZ’的5‘端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ’的合成。不能互补。lacZ’5’3’

肽移码突变lacZ’5’3’

肽不互补互补MCS外源DNA④IPTG的诱导作用IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ的C端部分和载体的lacZ’

肽都表达。从而互补。但载体MCS上插入外源DNA后，仍然不能产生

肽！IPTG通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。MCS无插入时，互补，蓝菌斑。MCS有插入时，不互补，白菌斑。IPTG诱导的结果：（5）pUC系列载体的优点①更小的分子量：如pUC18为2682bp，pUC8为2750bp。②选择方便Xgal显色、抗菌素双重直接选择。③克隆便利具有多克隆位点（MCS），使有两个不同粘性末端的外源DNA方便地插入。④测序方便第二节噬菌体载体（Bacteriophage，简称phage）T4Bacteriophage

一、噬菌体的一般生物特性

可脱离寄主细胞生存，但不能进行复制。除了对寄主的依赖性，还具备其它的功能：1、保护自己的核苷酸分子（DNA、RNA）免遭环境化学物质的破坏；2、将其核苷酸分子注入到被感染的细菌细胞；3、将被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体系，从而长生出大量的子代噬菌体颗粒；4、使感染的细菌细胞释放出子代的噬菌体颗粒1.噬菌体的结构和其核酸类型：结构：无尾部结构的二十面体型、具尾部结构的二十面体型、线状体型核酸类型：最常见的是双链线性DNA、双链环形DNA、单链环形DNA、单链线形DNA、单链RNA。2、噬菌体的生命周期噬菌体的溶菌生命周期噬菌体的溶原生命周期（1）噬菌体的溶菌生命周期噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：1、吸附吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上2、注入噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞3、转变被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒