中药川芎对犬心肌缺血保护作用谱效关系及药效物质基础研究

中药川芎对犬心肌缺血保护作用谱效关系及药效物质基础研究

川芎是波形科植物的干燥根茎。性温,味辛,具有活血行气、祛风止痛之功效。川芎对心肌缺血损伤有保护作用,其中含有挥发油、生物碱、内酯类、酚类、有机酸等多种成分。鉴于川芎药材成分复杂,药效物质难以确定,采用目前被国内外广泛接受的特征指纹图谱分析,及此基础之上的药物活性物质与特征指纹图谱的谱效模型,可客观体现中药的复杂性和整体性。本研究采用高效液相色谱(HPLC)法建立了川芎药材的特征指纹图谱,运用建立的犬心肌缺血模型,从组织器官水平和酶学范畴研究特征指纹图谱,对其药效物质进行了系统的、多层次的评价筛选;将活性成分特征峰的特征指纹图谱与药效结果相对应,并通过建立在特征指纹图谱上的谱效相关性研究模型,客观反映中药川芎的内在质量,为该类中药的质量控制和药效评价提供了理论依据。1材料表面1.1药物对照品和试剂高效液相色谱仪(四元泵,1100色谱工作站,Agilent公司);川芎药材,由山东大学药学院生药教研室鉴定。川芎嗪对照品(批号0803-201112,纯度:99.0%)、阿魏酸对照品(批号905-201115,纯度:99.0%)、川芎内酯对照品(批号1006-201201,纯度:99.0%)、藁苯内酯对照品(批号0708-201110,纯度:99.0%),以上对照品均购自中国食品药品检定研究院;乙腈(色谱纯,MerckKGaA,64271Darmstadt,Germany)。SC-M5型麻醉呼吸机(上海医疗仪器厂);752型光栅分光光度计(上海分析仪器总厂);LD5-2A型离心机(北京医用离心机厂)。肌酸激酶(CK)试剂盒(批号20111010)、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(批号20111230)均为南京建成生物工程研究所生产。荧光素-荧光素酶缓冲液(中科院上海植生所);RAN-DOX公司试剂盒(CAT.NO.分别为:ENR:U90625,FA115;ENR:T77192,LC2389;ADM:J64951,CK112);复方丹参滴丸(天津天士力制药股份有限公司,批号110820)。1.2实验动物健康杂种犬,30只,体质量10~15kg,雌雄兼备,购自青岛市药检所实验动物中心,实验动物合格证号码:2012A030。2方法2.1特征指纹图的创建2.1.1检测条件0.1e以BDS(200mm×4.6mm,5μm)C18柱为分析柱,以A∶甲醇-B∶1%冰醋酸水溶液为流动相,梯度洗脱,[10∶90(10min)→20∶80(20min)→30∶70(30min)→30∶70(60min)V/V],流速为1ml·min-1,柱温为室温,检测波长为322nm,灵敏度0.1AUFS。在上述色谱条件下,川芎中川芎嗪、阿魏酸、川芎内酯A、藁本内酯均达到基线分离,与相邻色谱峰的分离度>1.5,拖尾因子均在0.95~1.10之间,理论塔板数按川芎嗪、阿魏酸计算不低于4500,且峰对称因子符合中国药典要求。2.1.2样品制备及预处理精密称取川芎药材粗粉(过40目筛)约100mg,精密称定,置于10ml棕色量瓶中,精密加入0.1ml冰醋酸后,再加入90%甲醇稀释至刻度,经预试验筛选实验条件,超声时间为18min,0.45μm微孔滤膜过滤,滤取澄清液,上述样品备HPLC分析使用。2.1.3川芎嗪峰保留时间和峰面积积分值的计算精密称取供试品溶液20μl,注入HPLC仪,记录60min色谱图。川芎嗪是该药物中含量较多且最稳定的峰,故选择川芎嗪为参照峰(S)峰,以其保留时间和色谱峰峰面积积分值为1,计算其他峰的保留时间和峰面积积分值与基准峰的保留时间和峰面积积分值之比。2.1.4仪器精密度试验精密吸取同一供试品溶液,在2h内重复进样5次,测定HPLC色谱图,结果各共有峰相对峰面积的RSD均小于1.50%,相对保留时间的RSD均小于0.75%,仪器精密度良好。2.1.6特征指纹图谱测定精密吸取川芎供试品溶液,分别放置在0,2,4,6,8,10h时测定特征指纹图谱,计算其峰面积的RSD均小于1.95%,相对保留时间的RSD均小于0.98%,表明供试品溶液在10h内稳定。2.1.7对照品的制备按上述方法测得10批药物的特征指纹图谱,在相同的保留时间有峰出现,川芎内酯A的保留时间为8.45min,藁本内酯的保留时间为15.01min,川芎嗪的保留时间为19.56min,阿魏酸的保留时间为25.79min。精密称取上述对照品各10mg,置100ml量瓶中,加入90%甲醇稀释至刻度,摇匀,在上述色谱条件下检测,所得对照品图谱如图1所示。为了能简便、快速地建立川芎质量控制评价模式,选择了特征指纹图谱中包括上述4个色谱峰在内的7个峰作为考察指标,其相对保留时间的RSD为0.60%~0.95%,相对峰面积积分值比值的RSD为1.16%~2.98%。2.2保护狗心肌缺血并重新注入伤口2.2.1试验方法将犬随机分为6组,每组5只,给药剂量按公斤体质量转换公式Db=Da×(Kb/Ka)×(Wa/Wb)1/3计算而得;同时对川芎(以提取物计)的剂量设置做了考察,测定了LD50,根据实验结果,选取了高、中、低3个剂量组。(1)模型组:等容积生理盐水;(2)复方丹参滴丸组:60mg·kg-1;(3)川芎提取物Ⅰ组:15mg·kg-1;(4)川芎提取物Ⅱ组:30mg·kg-1;(5)川芎提取物Ⅲ组:60mg·kg-1。2.2.2试验步骤实验犬称重后以3%戊巴比妥钠30mg·kg-1静脉麻醉,分离气管并插入气管插管,接SC-M5型麻醉呼吸机,待开胸后行机械通气,呼吸频率16~18次/min,潮气量350~550ml。沿胸骨左缘第4肋间开胸,暴露心脏,剪开心包并作心包吊床。在左冠状动脉前降支第二至第三分支间游离冠状动脉,并在其下穿二根丝线,备用于两步结扎。采用Harris两步结扎法:首次结扎前2min,从股动脉静注利多卡因5mg·kg-1预防心律失常。在结扎时将一段直径1mm的钢丝插入第一松结内,将钢丝与冠状动脉一起结扎,而后抽出钢丝,30min后完全结扎第二结。完全结扎时灌胃给药,给药体积为2ml·kg-1,阴性对照组给同体积生理盐水。冠脉结扎前及结扎3h后各取冠状窦静脉血及股动脉血3ml测血液生化学指标。取血200μl直接注入预冷的内含0.4mlTris-HCl缓冲液中,使总体积为3ml,摇匀立刻在沸水中煮沸5min,3000r·min-1离心5min,放入冰浴,取上清20μl于小玻管中,放入FGJ-91发光光度计暗室,注入0.4ml荧光素-荧光素酶缓冲液,立刻记录发光强度,取3次平均值,标准曲线制备参照有关说明书。2.2.3给药路径和观察指标给药途经:灌胃给药;观察指标:犬血清游离脂肪酸(FFA)、血清激酶(CK)、血乳酸的改变。2.2.4数据和统计分析3结果3.1复方丹参滴丸对血清cc、ffa、乳酸的影响冠状动脉结扎后各组血清CK、FFA及乳酸均升高。其中,川芎提取物15~60mg·kg-1及阳性对照药复方丹参滴丸均能不同程度地降低血清CK、FFA、乳酸的升高程度,其中川芎提取物中、高剂量组(30,60mg·kg-1)效果显著,见表1,表2。3.2双变量相关分析运用双变量相关分析法建立谱效相关性数理统计模型:采用多元回归分析、相关分析、灰色关联度等数学方法,对川芎特征指纹图谱及药效学二者的相关性进行了考察,对特征指纹图谱与药效结果的内在联系进行研究。回归分析是研究一个或多个自变量与一个因变量之间是否存在某种线性或非线性关系的一种统计学方法。双变量相关分析是研究变量之间密切程度的一种统计方法,将药物HPLC特征指纹图谱各峰的峰面积与其治疗心肌缺血的各项指标进行回归分析和相关性分析,利用SPSS17.0统计软件线性回归分析、及双变量相关分析法处理,结果见表3~表5。综合回归分析和双变量相关分析结果,1,2,3,5号峰均与治疗心肌缺血作用呈正相关,通过研究单个指纹峰面积与血清中各项指标的关联,发现均能不同程度地降低血清CK、FFA、乳酸的升高程度,对药效为增强作用,药效成分主要来自1号峰,2号峰,3号峰,5号峰,对照特征指纹图谱中各对照品的保留时间,证明其治疗有效成分分别为川芎内酯A、藁苯内酯、川芎嗪、阿魏酸。4讨论4.1色谱条件的确定在流动相的选择上,本实验先后应用甲醇-水和乙腈-水为流动相进行分离,比较之后发现,甲醇-水较之乙腈-水体系,有机相用量少,柱压低,色谱峰较尖锐,分离效果好。因川芎药材化学成分较多,极性范围跨度较大,后经预实验筛选了不同比例不同梯度甲醇对各药效物质的分离效果,根据筛选,综合考虑各有效成分的分离情况,保留时间和基线漂移程度等因素,选定了适宜的甲醇、水梯度洗脱程序,并加入适量冰醋酸调节pH值,有效改善了色谱峰的拖尾现象。采用二极管阵列检测器对检测波长在200~400nm范围内进行了考察比较,发现当检测波长小于280nm时基线有明显漂移,而波长大于325nm时色谱峰数目开始减少,在322nm处各色谱峰均有较强紫外吸收,色谱信息丰富,分离度好,故选定此波长为检测波长。4.2药养结合,各组大鼠心肌组织病理学指标比较冠状动脉结扎可导致心肌细胞的缺血、缺氧,糖的有氧氧化过程受阻,细胞膜稳定性降低,从而引起酶的外漏,肌酸磷酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)释放入血,导致心肌细胞及其周围组织溶解、坏死。实验结果表明,川芎可使急性心肌梗死犬的血清CK活性明显降低,提示川芎提取物可以阻止胞质中存在浓度较高的一些酶的大量溢出,在一定程度上减轻了细胞膜损伤程度,改善心肌代谢。急性心肌梗死时心肌的有氧氧化过程障碍,对脂肪酸的氧化和再利用减少,使血中FFA显著增高,FFA过高进一步造成心肌损害,加重心肌缺血。实验结果显示,川芎提取物可明显抑制心肌缺血时FFA代谢的紊乱,对心肌细胞有保护作用。中药药效物质基础是中药化学特征指纹图谱的本质,运用现代先进的分析手段建立的中药药效物质数据库系统,为本实验奠定了研究基础。本研究将特征指纹图谱技术运用于中药复杂成分的化学信息的采集,通过分析特征指纹图谱信息与药效活性的相关性,从中选取代表性成分作为药效物质基础,不但可系统表征该类中药复方整体成分-药效的相关性,也为中药追踪分离药理活性成分,研发新药提供了新的思路。2.1.5中药质量使用差异显著性研究平行取同一供试品5份,在一天内测定HPLC色谱图,结果各共有峰相对峰面积的RSD均小于1.50%,相对保留时间的RSD均小于0.95%,表明本实验重现性好。实验数据以ue0af±s表示,用方差分析检验差异的显著性。中药化学成分复杂,研究和表征其药效物质基础难度较大。本实验双变量相关分析、回归分析与药效试验结果基本一致,川芎内酯、藁