棉花规模化转基因技术研究进展

棉花规模化转基因技术研究进展

1棉棉转向技术研究与应用棉花是世界上最重要的纤维木材和重要的油材料之一。常规遗传育种方法和手段虽然在提高棉花产量和抗性方面取得了长足的发展,培育成了一系列的优良品种,但在解决棉花棉铃虫、黄萎病、提高纤维品质等问题上遇到了巨大的挑战。棉花是目前少有的几种已投入商品化生产的转基因农作物之一,自1996年转Bt基因抗虫棉投入商品化后,转抗除草剂基因棉、抗逆棉也相继进入生产试验阶段,同时棉花基因工程在抗病、抗旱、耐盐等方面的研究也初见端倪,近年来转基因技术的应用,使棉花的基础与应用研究日新月异(表1)。在棉花转基因研究与应用的初期,主要以建立转基因体系为主,目的基因为标记基因和不同类型的Bt基因,受体材料主要是美棉coker201或coker312,该材料转化率较高,但在中国其农艺性状不佳。国内则首先以抗虫基因等为目的基因,以生产中应用的棉花新品种为受体开始建立体系并获得大量转基因材料。花粉管通道法在棉花转基因初期曾大量应用,随着农杆菌介导法的逐步成熟,该方法的应用比重逐步加大。部分新方法如祝水金等的茎尖农杆菌转化法也开始取得成功。近年来,RNAi等在棉花中也取得较大进展,更多研究者将功能基因导入棉花[20,21,22,23,24,25],建立转基因体系,获得新基因的功能。在国内,转基因抗虫棉已大量种植。棉花的转基因技术的基础是组织培养,而棉属的组织培养在作物中是最难的一个。从1971年Beasley首次报道从陆地棉的胚珠诱导出愈伤组织,直到1986年,Shoemaker等才报道了陆地棉珂字棉312和珂字棉201的再生植株。经过近20年的发展,国内外研究已经获得了戴维逊氏棉(GossypiumdavidsoniiKellogg)、雷蒙德氏棉(GossypiumraimondiiUlbrich)、瑟伯氏棉(GossypiumthurberiTodaro)、拟似棉(GossypiumgossypioidesUlbrich)、草棉(GossypiumherbaceumL.)、亚洲棉(GossypiumarboreumL.)、海岛棉(GossypiumbarbadenseL.)和陆地棉(GossypiumhirsutumL.)等棉种的再生植株,并建立起了体细胞培养、花药培养、茎尖培养、胚珠和胚培养以及原生质体培养等不同的培养体系。很多实验室通过胚胎发生途径获得了棉花(主要是陆地棉)再生植株,并建立一些棉花组织培养的体系。1.1由外植体转化为优势的基因资金转化技术目前,在棉花中用于遗传转化的方法主要有农杆菌介导法、基因枪轰击法和花粉管通道法3种。农杆菌介导法:农杆菌介导转化法可以高效地将外源基因整合到棉花基因组中,外源基因可以稳定遗传和高效表达,它必须以组织培养为基础。自1987年,Umbeck等和Firoozabady等先后报道了农杆菌介导的棉花遗传转化得到转化植株以来,国内外研究者先后建立了以珂字棉等品种为受体的再生体系,并取得巨大进展[6,34,35,36,37,38,39,40],为棉花重要基因的功能验证和利用等工作提供了良好的技术平台。在机理研究方面,棉花体细胞胚发生过程中体细胞胚起源、形态建成和胚胎学发育等相关的研究报告较多。此外,棉花体细胞胚发生和再生过程中常伴随着大量的畸形胚和畸形苗,与此相关的研究也有报道。在棉花的组织培养性状等方面已进行了诸多研究:不同类型外植体的体细胞胚能力差别很大,即使在同一品种棉花不同外植体的体细胞胚发生能力也存在很大的差异。体细胞胚发生能力以下胚轴最容易,子叶较差,真叶和茎最差。目前,陆地棉的组织培养主要以下胚轴为外植体,通过脱分化和再分化得到再生植株。张朝军等发现中棉所24号的叶柄也具有较强的分化能力,并在基础上建立了以叶柄为外植体转化体系。基因枪轰击法:基因枪轰击法是继农杆菌介导法之后在棉花转化中应用最广泛的一项技术。该方法具有受体类型广泛(茎尖、下胚轴、胚性细胞悬浮系等均可以作为转化的受体)、受体无基因型限制(很多的棉花品种已经通过该方法得到了转基因植株,部分的品种已经商业应用)等优点。1987年,美国Cornell大学的Klein等首次以洋葱表皮细胞为材料,以钨粉为子弹,把DNA、RNA导入细胞,且观察到外源基因能表达,证明了基因枪轰击转化方法的可行性。1990年,美国俄亥俄州立大学的John等第一次将此技术应用于棉花遗传转化中。目前报道的棉花基因枪转化效率只有4%左右,有很大的提升潜力。影响基因枪转化效率的因素很多,主要分为物理因素、生物因素和培养程序等。基因枪法多以棉花胚性愈伤组织和茎尖分生组织作为受体材料,以1μg·μL-1的高纯度质粒包裹金粉粒,进行轰击。现在,笔者实验室筛选出转化效率较高的3种载体pBI-121、pCAMBIA2300和pCAMBIA2301,并成功建立了规模化基因枪轰击转化体系,每周轰击100—150枪,转化效率可达到4%以上。基因枪转化后的培养较为重要,其中恢复培养和抗性筛选两个过程尤为重要。随着研究的开展,基因枪的转化率由原来的0.001%—0.01%提高到4%左右,其转化周期缩减为3—4个月,成功率高达94.1%。年转化规模,例如中国农业科学院棉花研究所(以下简称“中棉所”)等,可达到约1200转化体/年。花粉管通道转化法:1979年发表的“远缘杂交的分子基础DNA片段杂交假设的一个论证”一文,为花粉管导入外源DNA的整合奠定了理论基础。1983年,Zhou等在“MethodsinEnzymology”杂志上报道了棉花花粉管导入外源DNA获得成功的文章。这一技术的建立为活体基因的转化开创了新途经。Trolinder等报道的一种原位转化方法并申请了专利。通过子房注射法技术,已将抗虫、抗病、抗除草剂、纤维品质改良等不同基因导入棉花品系,获得了转基因棉株。目前,棉花转化中,通过此方法已得到了多个转基因抗虫棉新品种(品系),其中部分已经审定并在生产上大面积推广应用。但该方法受环境和人为操作等因素的影响大,转化过程仍带有相当的随机性,转化率比较低,外源基因的插入多拷贝比例较高。随着分子生物学和基因工程的发展,外源DNA可通过花粉管通道导入植物胚囊这一事实越来越多地被许多学者所证实,同时也说明DNA片段杂交的存在。应用这一技术存在的问题:应用总DNA片段的导入,筛选到的子代仍可能带入目的基因以外的片段。这一技术局限在于只能用于开花植物,且只有花期可以进行转育。方法虽然简单,但外源基因能否与受体基因整合,决定于目的基因的性状与功能是否与受体基因组DNA和细胞代谢相容。在自然田间进行操作,受环境条件的影响很大。外源基因的导入具有很大的随机性。目前,虽然建立了一些棉花的再生体系,中棉所还发展出了以中棉所24号模式转化品种的规模化转基因体系。但从整体上看,受体材料选择范围狭窄等问题仍然制约着生物技术在棉花生产中的广泛应用。为拓宽转化的受体范围,基因型对棉花体细胞胚发生能力的影响及其遗传机制一直是研究的热点,这对再生性状相关基因的定位、克隆及解释再生能力品种依赖性等问题具有重要的意义。至2005年,中棉所对棉花转基因技术体系进行多年研究,建立起以农杆菌介导法、花粉管通道法为主,基因枪轰击法为辅的三位一体棉花规模化转基因技术体系。该体系已将双价抗虫基因、反式抗棉蚜基因、棉纤维品质改良基因、雄性不育基因等目的基因导入到不同的棉花品种中,并达到了年产转基因植株2000株以上的水平。1.2抗虫、抗病药等方面的进展棉花是世界上转基因研究与应用最成功的作物之一,在抗棉铃虫、抗除草剂等方面已取得巨大成功。棉花是世界上播种面积居第四位的转基因作物。到2013年,转基因抗虫棉在中国占棉花播种总面积的85%以上。表2是目前已产业化的基因及品种。2总体材料的基因组织转化在转基因专项等项目的资助下,中棉所与国内相关研究单位合作,建立了棉花规模化转基因技术体系,对农杆菌介导法、基因枪轰击法、花粉管通道法进行了大量研究与改良,验证了大量功能基因与载体,累计培育了2000余份棉花新材料。以下内容主要是该转基因体系的主要进展,主要数据不再另文发表。以扩大转基因受体材料基因型为目标,利用筛选出的优良载体,结合已验证功能的目的基因,以50余个棉花品种(系)为转基因受体,同时进行培养体系的适当优化,建立了27个品种(系)的转基因技术体系。以转化率为依据,可将这些材料分成3类:Ⅰ总体转化率5%以上的5个品种:CRI24、冀合321、冀合713、泗棉3号、鲁棉6号。其中,CCRI24成为中国棉花转基因的模式品种;Ⅱ总体转化率0.5%—4.9%的9个品种:CRI27、CRI13、CRI19、CRI17、CRI35、中51504、中135、中394;Ⅲ总体转化率0.5%以下的11个品种(系):中8036、中2468、中8037、CRI12、中3316等14个品种(系)。为进一步提高这些材料的转化效率,利用建立的棉花叶柄组织培养技术体系,以棉花大田活体材料的叶柄为外植体,进行组织培养,筛选其中的高分化率材料(表4),其中W12、W13等5个单株的分化率可达100%,而W07等单株在该培养体系中不分化。将分化率达100%的W12自交纯合后,以其为新的转化受体,使转基因过程中转化率提高了约2.55倍。张朝军等进一步通过分子标记研究发现,单株间分化率的差异受2个分子标记控制。虽有少数研究宣称建立了直接发生途径的转化体系,但棉花的农杆菌介导法目前仍然以间接发生为主,需要经过胚性愈伤—胚状体的阶段,且该阶段为棉花农杆菌介导法转化的关键步骤。利用选育的高分化率材料,建立了稳定的棉花无菌苗下胚轴组织培养体系。用的组织培养体系是本课题建立的CCRI24的模式化培养体系,由以下5种培养基组成:Ⅰ无菌苗培养基MS0:MS培养基的大量元素+25g·L-1蔗糖+2.5g·L-1Gel,加自来水定容到1L;Ⅱ愈伤组织诱导培养基MSB5:MSB培养基附加IAA、KT、2,4-D各0.1mg·L-1,并附加25g·L-1的葡萄糖,2g·L-1Gel,pH=6.5;Ⅲ分化培养基MSB6:MSB附加0.05mg·L-1IAA+0.15mg·L-1KT+25g·L-1葡萄糖+2.5g·L-1Gel,pH=6.5;Ⅳ胚性愈伤增殖培养基MSB7:MSB培养基,附加0.1mg·L-1KT+0.15mg·L-16-BA,pH=6.8;Ⅴ胚状体萌发成苗培养基MSB8:MSB培养基附加0.1mg·L-1KT+0.2mg·L-16-BA+25g·L-1蔗糖+2.5g·L-1Gel,pH=6.8。利用上述20个株系所建立的高效再生技术体系进行农杆菌介导转化,保证了外源基因经过一次遗传转化,700个外植体就可以得到200个左右的独立转化体。经5—6个月后就可以获得转基因再生植株,然后进入外源基因功能评价体系。以该体系为主的“棉花组织培养性状纯化及外源基因功能验证平台构建”2010年获国家发明二等奖。棉花农杆菌介导法转化的流程如图1。在笔者建立的农杆菌介导体系中,在原有转化体系的基础上,主要进行了以下改良:2.1.3.分子身份证的发现和应用此步骤是棉花农杆菌介导的关键步骤,培养基的调整至关重要。由于不同载体及不同愈伤组织对培养基的需要都有所不同,在此将调整的原则概述如下:降低激素的用量可提高胚性愈伤组织的发生率:过高的激素含量会使愈伤组织水化严重且不易分化,但若愈伤组织硬化则证明过低。愈伤组织继代的时机也非常重要:大约40d的愈伤组织比较适合继代,此时的愈伤一般呈现暗黄色、较酥松。一般不需要悬浮培养,因为该处理容易引起细胞的大量变异。为检测培养体系是否合适,可采用镜检:将愈伤组织直接在荧光显微镜下观察GFP荧光。在卡那霉素抗性愈伤组织、胚性愈伤组织、非胚性愈伤组织和体细胞胚中均可以检测到GFP的荧光信号,抗性愈伤组织中有90.0%—96.0%的转化系可以观察到GFP荧光(图2),若细胞结构完整、团状大小适中,基本可表明培养体系较合适。由于棉花的离体再生仍然存在严重的基因型限制,国内外诸多研究者试图利用分子标记技术以发现其遗传标记,从而筛选出更适合于遗传转化的受体材料。Gawel等研究认为再生能力可以遗传,为数量性状。张家明等提出品种的局限性具有一定规律,在美国爱字棉和斯字棉系统难再生,岱字棉极难或不能再生,珂字棉系统最易再生;在中国,黄河流域品种容易,长江流域品种困难。一个封闭基因系统(blockergenesystem)控制着再生性状。张朝军等发现CRI2对主基因的加性效应均为正值,均使分化率提高。2个F2群体显示的主基因遗传率分别为83.22%和74.68%,多基因遗传率分别为10.47%和16.78%。Xu等为深入了解棉花体细胞胚胎发生(SE)的分子机制,用RNA-Seq方法对不同的姐妹系间体细胞胚胎发生的转录组动态进行分析。214977462个读长从头拼接得到204349个Unigenes。qRT-PCR验证基因表达与RNA-Seq测序结果正相关(R2=0.841,在0.01水平显著相关)。培养基中植物激素(生长素和细胞分裂素)浓度比的不同和这两种激素在不同姐妹系间2个时期的内源含量变化暗示生长素和细胞分裂素在棉花体细胞胚胎发生中的作用。所有调控植物激素相关基因中,差异表达转录本有很多基因涉及到生长素与细胞分裂素合成、信号转导途径,参与这些途径的差异表达基因分析揭示了2个姐妹系间基因类型及表达丰度发生了实质变化。分离、克隆、沉默/过表达这些在棉花体细胞胚胎发生过程显著上调或下调的基因极其重要。此外,生长素和细胞分裂素在SE中发挥主要作用,但彼此或与其他因素间潜在的相互作用仍不清楚。2.2基因枪击穿转化法在建立的转基因技术体系中,对棉花基因枪轰击体系进行了大量改良,主要是对外植体的选择、筛选标记的扩展等方面。基因枪轰击转化法的流程基本如下:外植体→质粒DNA轰击→恢复培养→筛选培养→嫁接→移栽→分子检测→收获种子进行田间筛选。在此流程中,主要针对其中的部分关键步骤进行了改良。2.2.1胚性愈伤组织的撞击以棉花组织培养获得的胚性愈伤组织取代了顶端分生组织,使转化规模扩大2—3倍。以组织培养获得的CRI24、CRI12等材料的胚性愈伤组织为外植体,经过3mol·L-1山梨醇渗透液体振荡培养1—1.5h,过滤出细沙粒状愈伤组织,滤纸上吸去培养液,晾干后即可进行轰击,一般选择轰击2—3次。此方法可加大轰击频率1—2倍,以往以采用顶端分生组织为主,需要大量时间进行解剖镜下剥离出它们,每人每天只能轰击约10个处理,每周只能轰击2—3d,采用胚性愈伤组织后,每周可轰击4d,每次15—20个处理。但此方法只能适用于已建立了组织培养体系的受体材料,尚未建立的材料仍然需要以顶端分生组织为外植体。2.2.2筛选材料及用量建立了以潮霉素、草甘膦等为筛选标记的基因枪轰击转化体系,以抗虫棉为受体可大量获得转基因材料。棉花对潮霉素和草甘膦都比较敏感,相对于卡那霉素,需降低培养基中筛选物资的浓度,目前潮霉素以5ppm开始筛选,经过3次梯度增高至25—30ppm,即可获得5%—10%的抗性愈伤组织,其获得的转基因材料约2/3为阳性植株。以草甘膦为筛选标记时,其对应浓度分别为0.5和5ppm。由于目前国内的转基因材料在长江流域、黄河流域已大量种植,近年来的天气异常使获得足质足量常规棉为受体的难度日益加大。因此,这些转基因体系的建立具有明显的促进作用,但会加大转基因安全性评价的难度。2.2.3降低嵌合体比例采取必要的措施降低嵌合体:其一,必要时可对质粒DNA进行酶切。其二,加大筛选强度可适当降低嵌合体比例(但会降低转化规模)。其三,转基因植株分子检测后获得的阳性植株需严格自交,尽量分单铃收花,降低因嵌合体产生的后期材料选育的难度。2.3布氏原螯虾对棉花的诱导诱导利用花粉管通道法在转基因棉花的研究中主要有3种方法,包括子房注射法、真空渗透转化法和柱头滴加法。目前,主要以子房注射法为主。子房注射法(微注射法):一般方法是在棉花盛开期,选择白花授粉后24h左右取自交受精的隔日幼铃(花冠由自色变红色),抹平花柱,用合适的注射器把外源DNA注射进棉花子房即可。棉花花粉管通道法转化已培育了大量转基因棉花新品种,如CRI41(2009年获国家科技进步二等奖)等。为提高转化率,笔者对诸多步骤进行了改良,需注意以下因素对转化率的影响。3采用棉花分散转移技术体系3.1抗虫棉花转化中棉所为棉花育种供了大量育种材料。其中,抗棉铃虫材料已培育大量转基因棉花新品种(表6)。3.2其他研究单位近年来,利用已建立的棉花高效规模化转基因技术,累计为专项其他课题国内41家科研院所单位转化基因234个。这些单位包括清华大学、北京大学、中国农业大学、上海交通大学、复旦大学、中山大学、华南农业大学、华中农业大学、山东大学等大专院校以及中国科学院遗传发育研究所、微生物研究所、植物生理研究所等,中国农业科学院生物技术研究所、植物保护所等,山东省农业科学院等研究单位。同时,创制了大量的具有应用潜力的育种新材料(表7)。例如,利用该平台创制的第二代转基因改善纤维品质、提高作物产量等为主要目标的棉花新材料(RRM2、ACO1),经农业部批准已面向全国30多家育种单位进行发放。通过棉花规模化转基因技术体系为“973”、强优势“863”等专项外,其他课题验证基因20个,累计创制不同类型的具有应用价值的转基因育种材料510份,并提供给了“973”计划项目“目的基因在棉花中的高效功能验证及评价”、强优势“863”项目“强优势棉花杂交种的创制与应用”、“抗病及转基因早熟棉花新品种培育”、“转基因杂交棉花新品种培育”及“棉花产业体系等项目进行新品种培育研究”。4家的共同愿望长期以来培育具有高产、优质、抗病虫害、抗逆境等多个优良性状的棉花新品种,是每一个从事棉花遗传改良科学家的共同愿望。为培育出育种需要的转基因棉花材料,扩大转基因材料的受体基因型仍然是棉花转基因研究中首要问题。同时,为提高效率和减轻安全性的公众焦虑,探索和发现新的更为安全和有效的转化体系,如多基因共转化、叶绿体转化、标记基因删除和新选择标记等研究引起人们的普遍关注,是未来棉花转基因技术的发展趋势。4.1制备新材料的需要。在已经设置扩大棉花转基因受体材料基因型范围、提高转化效率、扩大转化规模是棉花转基因技术体系的长久主题。(1)扩大受体材料基因型范围,是培养适合不同生态类型的转基因棉花新材料的首要手段。中国棉花生态区气候、土壤、种植模式等差异巨大,少数几个品种为转化受体无法满足育种需要,因为目前已建立良好转化体系的CRI24等材料已成为过时品种。近年来采用分子标记等方法已开始取得部分进展,但尚无法进行应用。目前扩大转基因材料受体基因型的努力仍然局限于培养基和培养程序的改良上。(2)在提高转化效率上,目前需要在载体构建、转化体系改良等方面加大研究力度。(3)扩大转化规模为筛选出更多更好的材料提供了更大可能。4.2新方法和新方法的应用已经日新月异棉花在转基因新型载体和新方法的研究已取得较大进展,但在TALEN等新技术上目前仅处于起步阶段。4.2.1标记基因的筛选和多聚蛋白酶解法多基因转化在棉花中已取得进展,并将逐渐在生产和研究中加大影响。多基因载体的构建策略主要有独立表达框组合法、多聚蛋白酶解法。表达框组合法:目的基因的两端均具有各自的启动子、增强子、终止子等转录和翻译调控元件,将多个表达框串联在一起共同组建于一个表达载体中。采用这种构建方式时,须要先对融合蛋白的多个功能区的活性、稳定性等特性进行验证。调控原件的选择,既要保证目的基因的特异性高效表达,又要避免使用相同调控序列而引起同源重组导致基因沉默。另外,筛选标记基因的选择也十分重要,既要方便对多个目的基因的转化后代的筛选,又要避免标记基因在受体材料中的积累。目前,筛选标记基因的安全问题颇受争议,所以有时要考虑利用新型安全的选择标记,或利用抗除草剂基因充当标记基因等。最后,载体上各元件的安排也需要慎重考虑。中棉所将已验证功能的多个基因构建在同一个载体上,分别进行以抗虫棉(载体为pBI121-IAP-RRM2-EPSPE-HS1-GUS)、常规棉(载体为pBI121-IAP-RRM2-P35-BT-EPSPE-HS1-GUS)为受体的转化,并获得了转基因材料。该技术体系虽然有效,其试验操作性比较复杂,组装效率较低,还需要进一步改良简化其操作和提高效率。多聚蛋白酶解法:将多个目的基因的内含子序列融合在一起,构建在同一表达框(OFR)内,使多个基因在同一个调控元件下转录成为一个聚合mRNA,翻译后得到一个由不同的功能多肽结合在一起而形成的融合蛋白。1994年,Salm等将含cryIA(b)和cryIC的融合蛋白基因表达载体成功地转入到烟草和番茄中,获得了抗多种害虫的转基因阳性植株。考虑到所获融合蛋白的结构、功能的复杂性及有时必须得到各目的基因的表达产物时,还可以在各基因之间插入编码某个蛋白酶特异识别位点的DNA序列。这样,融合蛋白一旦翻译成多肽,就可以通过相应的酶解过程使其分离,表现出各自的功能,并且彼此间不受影响。需要注意的是,以往的将多种质粒进行混合,再以农杆菌介导或基因强轰击进行的共转化,因效率低、检测难度极大、材料筛选困难等原因已基本被摈弃。随着需要转化的目的基因数量的增加,多基因表达载体的容量是一个重要的限制因素,所以有必要发展大容量的人工载体系统,如YAC、BAC等表达载体系统。利用这些载体系统有可能实现多基因家族的连锁转化,同时还得发展相对应的基因转化技术,将大容量载体有效地导人到棉花基因组中,提高转化率并保证多个目的基因进行整合时不发生分离和丢失。4.2.2基因定点整合技术基因定点整合技术,是指构建在目的基因表达框两端含有与受体基因组特定位点同源DNA片段的整合载体,通过各种转化方法,使同源DNA序列与受体基因组序列之间发生同源重组,从而使目的基因插入到特定的受体基因组中,通过一系列的筛选培养,最终得到定向转化的再生植株。基因定点整合载体可分为两类:插入型载体和置换型载体。基因定点整合技术,不止用于外源基因的转化,也可用于基因的定点删除。目前,植物中成功利用基因定点整合技术的有烟草、拟南芥、水稻、玉米等,棉花中还未见定点整合技术应用的报道。目前,基因定点整合技术还存在着很多不足,整合频率较低,只在烟草、水稻和玉米等少数作物上进行了运用。目前,基因定点转化技术在棉花中的利用还存在着许多困难,但随着人们对基因同源重组原理更深入的了解及棉花基因组信息的公布,棉花基因定点转化技术会得到相应的改进和提高。2012年,中国农业科学院棉花研究所与中国科学院华南植物园DavidOw教授合作,开展了基因叠加转基因的研究,构建了适宜于棉花的以重组系统为基础的基因定点转化载体,目前正在进行棉花的遗传转化。4.2.3质体基因转化的优势质体转化技术是20世纪90年代兴起的一项基因工程技术。质体基因转化在一定程度上克服了核基因转化的不足,具有独特的优越性:(1)高效表达:每个叶片中的质体基因组拷贝数非常大,外源基因整合进去后,再生阳性植株的每片叶子的目的基因拷贝数必然极为极高,这就为基因的高效表达提供了条件。(2)原核表达系统,大多目的基因无需修饰改造:由于质体内的表达为原核表达系统,对于来自原核生物的或由mRNA反转录得来的具有重要价值的外源基因,无需改造和修饰就可在质体内高效表达,这是核基因转化无法做到的。(3)安全性好:外源基因整合进质体基因组后,只进行母系遗传,不会随花粉扩散,从而保证了基因工程的安全性。(4)便于遗传操作,并可以实现定点整合:质体基因组小,结构简单,许多作物的质体基因已被测序,正在进行深入的功能基因组学研究,其遗传背景较清楚,便于遗传操作。(5)易保持纯系、后代不分离:一旦得到纯合而稳定的质体转化体,由于外源基因的母系遗传特性,这种纯系的种子后代将永远保持为纯系,不会因为有性杂交而发生分离。作为安全新型的转化方法,质体转化还存在着转化效率低、载体构建困难繁琐等问题,还需进一步研究。美国已开始了棉花的叶绿体转化,并成功获得转化质体,华中农业大学与其合作研究。在中国,中国农业科学院棉花研究所已构建了2个转化载体,正在转化中。棉花规模化质体转化体系会很快建立起来,并为棉花性状的遗传改良带来新的生机和活力。4.2.4无选择标记基因的研究目前,中国转基因棉花的筛选标记多为卡那霉素抗性。以抗虫棉为受体的许多潮霉素抗性的材料目前无法进入安全性评价,需要进行该标记的删除,因此,需要无选择标记体系的建立。目前,应用于标记基因删除的分子生物学技术主要有4种:共转化法、转座子介导的再定位、同源重组法和定点敲除技术。棉花中,与中国科学院遗传与发育研究所合作,开展双T-DNA插入获得无选择标记转化技术的研究。目前,已获得转基因再生单株。新型安全标记基因:为了消除公众对转基因产品安全性顾虑,学者们除了积极建立标记基因删除体系之外,还努力研发新型的安全的筛选标记。随着研究的深入,学者们发现了一些糖类代谢酶等正选择标记基因、可实时监控的荧光素酶类、荧光蛋白家族和GUS等报告基因、植物来源的耐胁迫类基因和一些安全的负选择标记基因。这些标记基因不存在危害人类健康和环境安全的风险,又可快速的用于转基因作物的商业化应用。在棉花中pmi是最为成功的,山西省农业科学院棉花研究所已建立了其转化体系,并获得了上千株转化材料。5农杆菌诱导法与其他方法的结合在棉花具有生产应用价值的基因太少。目前取得商业化生产的基因仍然为BT和EPSPS等少数几个基因。大量新基因仍然处于材料阶段,其主要原因在于:其一,基因的效应达不到竞争优势,尤其在数量性状的改良上。或转基因材料存在着显著缺陷,尤其在产量上。这需要在载体构建上加大研究力度。其二,由于棉花的分子生物学技术相对困难,安全性评价所需要的证据难以取得。在插入片段完整性上具有较大困难,杨晓杰等研究发现,对利用农杆菌介导法获得的转基因棉花材料中,约50%的株系含有转化载体上T-DNA外围的侧翼序列,尤其LB外侧的载体序列出现频率较高,农杆菌转化植物也具有载体多余序列的插入。基于同样原因,由于安全性评价的要求提高,基因枪轰击法和花粉管通道法获得的材料通过安全性评价的可能性很低。农杆菌介导法的基因型限制仍然很严重,尤其在生育期较长的材料上,而这些材料的产量和抗性更好,需要加大研究力度以建立起转化体系。除对培养基等进行改良外,还可结合分子标记等新技术。当然,相对于烟草等模式作物,棉花的转基因周期仍然偏长。需要在畸形苗的克服、胚性愈伤组织的诱导等方面加大研究力度。畸形苗现象极大地消耗着劳动力、时间和金钱。若克服了此问题,可在现有基