常用心肌缺血模型的比较

常用心肌缺血模型的比较

目前，主要用于预防冠状动脉粥样硬化的实验研究，采用lagolff外心肌缺血置换术模型、左冠状动脉前降支结心肌缺血置换模型和异丙醇诱导心肌缺血模型。也有少量文献报道采用垂体后叶素诱导心肌缺血模型。本文从模型制作的原理方法要点、发病机制、观察指标及应用展望多个方面对常用的3种心肌缺血模型加以比较。1模型生产原则和方法的要点1.1合理控制血压心脏自动物体摘取之后,用有一定压力、温度(37℃)并充氧的修正洛氏液经主动脉根部灌流。灌流压力宜始终控制在100cmH2O(1cmH2O=0.098kPa)。心脏活动可通过张力换能器或压力换能器进行记录。Halapas等采用心脏起搏器(Harvardpacemaker)将心率维持在320次/min控制灌流压,关闭起搏器即造成全心缺血,打开即为再灌注。给灌流液后1min内心脏即开始恢复跳动,但心率较慢常有心律不齐,宜稳定10~20min,HR控制在200~300次/min为佳。灌流压力和灌流液温度要严格维持恒定。1.2左心肌梗死前充血该模型是通过开胸结扎冠脉左前降支造成左心室前壁供血中断,建立急性心肌缺血梗死模型,停止结扎即为再灌注。Wen等麻醉大鼠,气管插管后连接小型动物呼吸机机械通气。距胸骨左缘2cm处行胸廓切开,剪断第4、第5肋骨。微头无创缝合针连接6/0丝线从左冠状动脉前降支根部穿过将心脏轻轻放回胸腔恢复20min。经过上述操作过程,出现心律失常或血压持续低于70mmHg(1mmHg=0.133kPa)的被排除。手术结扎缺血时间多为30min,再灌注时间依据实验目的有2h、12h、24h、2d、7d、14d等。此法动物创伤大、死亡率高,要求术者技术娴熟。在麻醉期间应给动物采取保温措施。开胸时宜在短时间内调小潮气量,避免手术器械或拉钩损伤充气的肺组织。1.3剂量和常用剂量ISO是一个强的β受体兴奋剂,能通过加快心率、增强心肌收缩力等环节增加心肌耗氧量,造成心脏负荷过重,心肌微循环及代谢障碍。连续应用可形成心肌梗死样变化。造模方法多采用ISO间隔24h皮下注射2次。ISO给药量差异较大,剂量与死亡率不成比例关系。目前报道的最小剂量是Devika等用的0.5mg/kg。最大剂量为500mg/kg。此外5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、85mg/kg、100mg/kg、150mg/kg、200mg/kg均为常用剂量。60mg/kg以下剂量多用来诱导急性心肌缺血及药物对急性心肌缺血损伤的作用,大部分为可逆性损伤。85mg/kg及以上剂量多用来诱导心肌缺血致心肌梗死、坏死、纤维化及心肌重塑等方面的研究,损伤多为不可逆性。其中采用85mg/kg诱导心肌坏死模型的文献报道最多。Panda等分别用65mg/kg、85mg/kg、120mg/kg和200mg/kg的ISO诱导大鼠心肌缺血坏死模型,发现85mg/kg剂量最为理想。各种酶类、炎症递质和过氧化指标改变最显著,而心肌组织损伤程度为中等。2心肌缺血损伤形成机制的比较2.1tnf-和il-6对心血管疾病的作用Langendorff心肌缺血损伤以炎症损伤机制为主。炎症损伤因子有TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10等。在心肌缺血损伤中以TNF-α和IL-6的作用最明显。TNF-α能刺激中性粒细胞向心肌细胞浸润、聚集和释放可溶性递质。TNF-α还可刺激血管平滑肌产生一氧化氮合成酶,一氧化氮合成酶生成增多,肌动蛋白合成减少,使血管平滑肌细胞收缩较弱,加重心肌缺血。IL-6是冠心病的危险预测因子。无论是慢性心肌缺血还是急性冠脉综合征,IL-6的水平都升高。Cha等采用Langendorff法制作全心缺血模型。发现TNF-α表达升高,心脏收缩功能明显下降。2.2心肌梗死前体诱导表达手术结扎冠状动脉左前降支法以炎症损伤和细胞凋亡损伤为主。TNF-α、IL-1β、IL-6的水平受信号转导通路调节。目前报道的炎症损伤通路有TLR4通路、NF-kappaB通路、p38MAPK通路等。这些通路相互交织,形成复杂的网状结构,其中TLR4通路在心肌缺血性损伤过程中起关键作用。Andrassy等采用冠状动脉左前降支结扎法制作心肌缺血动物模型。发现坏死细胞和激活的免疫细胞能释放一种核因子叫做高迁移率族1(HMGB1),HMGB1作为配体结合TLR4,诱导NFκB的激活和TNF-α、IL-1β的大量产生,加重心肌细胞损伤。杨简等发现冠状动脉左前降支结扎法心肌缺血损伤后1hTLR4mRNA表达至高峰;心肌组织TLR4mRNA表达水平与心肌组织TNF-α水平呈正相关。Bcl-2基因家族是调节凋亡的主要基因家族,其中Bax蛋白可通过孔道形成增加线粒体外膜通透性促进凋亡,而Bcl-2则可与Bax结合抑制其作用而缓解凋亡。Osipov等报道结扎冠状动脉左前降支心肌缺血模型,凋亡前体蛋白PARP显著升高,存活前体蛋白Bcl-2、p-PKC显著下降,Bcl-2/Bax比值显著降低,caspase-3mRNA表达也明显增加。抑制心肌细胞凋亡能够减少50%~70%的心肌缺血梗死面积。表明抑制细胞凋亡成为药物治疗的重要靶点。2.3iso和采用体外治疗的心肌损伤的机制ISO皮下注射诱导法的心肌损伤机制以氧化应激和干扰线粒体能量代谢和呼吸链功能为主。脂质过氧化(MDA升高)、iNOS升高、氧自由基及过氧亚硝酸阴离子(ONOO-)大量产生是造成心肌组织氧化应激损伤的重要原因。在生理情况下,通过eNOS合成少量NO维持扩张冠脉血管,抑制血小板的黏附与聚集,防止血栓形成等生理功能。在创伤、缺血、缺氧等应激环境下,受炎症因子刺激,iNOS表达增加,产生大量的ONOO-和氧自由基,ONOO-具有很强的氧化和硝基化作用,可以使细胞膜脂质过氧化、核酸硝基化、DNA断裂,产生严重的细胞毒作用,导致心肌细胞凋亡、心室重塑或心肌功能障碍。Zhang等发现ISO诱导的心肌损伤严重程度与iNOS表达量呈正相关。Ribeiro等发现ISO诱导的缺血心肌组织iNOSmRNA表达明显升高。线粒体基质内含有脂肪酸β氧化和三羧酸循环所需的全部酶类,内膜上具有呼吸链酶系及ATP酶复合体,是心肌能量代谢的主要来源。Yuan等采用ISO5mg/kg腹腔注射诱导大鼠急性心肌缺血,发现心肌线粒体脂肪酸β氧化限速酶:肌型肉碱转移酶I(M-CPT-I)和关键酶:中链脂肪乙酰辅酶A脱氢酶(MCAD)mRNA表达均明显下降,过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)mRNA表达也明显下降。Devika等采用ISO100mg/kg间隔24h皮下注射两次,发现心肌线粒体三羧酸循环酶:异柠檬酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶活性显著下降。呼吸链标志性酶:NADH脱氢酶和细胞色素c氧化酶活性显著下降。Karthikeyan等采用ISO85mg/kg间隔24h皮下注射2次,结果心肌线粒体内细胞色素(b,c,c1,aa3)、磷脂和ATP显著减少,而胆固醇、三酰甘油和游离脂肪酸却显著升高。Prabhu等采用ISO200mg/kg间隔24h皮下注射2次,结果发现心肌线粒体组织蛋白酶-D(cathepsin-D)和β葡萄糖醛酸酶(beta-glucuronidase)活性显著降低,心肌线粒体膜稳定性下降。3心肌缺血损伤的监测指标3.1左心室收缩压力该模型能获得比较多的心功能、血流动力学方面的参数且能观察药物的即时效应。如:冠脉流量、心率(HR)、平均动脉压(MAP)、左心室最大收缩/舒张速率(±dp/dtmax,mmHg/s)、左心室舒张末期压力(LVEDP)、左心室收缩压力(LVSP)等。3.2血清和心肌生化指标该模型可监测造模过程中心电图、血流动力学变化,可观察造模后各时点的反应炎症损伤和细胞凋亡等生化指标和病理变化。心肌缺血的Ⅱ导联心电图表现为:ST段向上偏移>0.1mV,T波高耸超过同导联R波的1/2。血流动力学变化为:+dp/dtmax降低,-dp/dtmax延长,LVEDP升高。反应炎症损伤的重要生化指标有血清和心肌组织TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的水平,TLR4、NFkBp65mRNA及蛋白的表达水平。反应细胞凋亡程度的生化指标是Bcl2、Bax、Fas和FasL、caspase-3、caspase-9等。3.3iso诱导心肌组织模型该模型可监测造模后心电图、血流动力学变化以及造模后各时点的氧化应激和干扰线粒体能量代谢的生化指标和病理变化。Wu等记录Ⅱ导联心电图为ST段抬高>0.1mV,约在30s时,T波显著高耸,ST段抬高,甚至出现单向曲线。反应心肌损伤程度的生化指标有:肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)等。Karthikeyan等用ISO诱导心肌缺血模型,血清及心肌组织中AST、ALT、LDH、CK和CK-MB水平明显升高,4h达高峰。心肌组织iNOSmRNA表达增高,SOD表达下降。病理观察方面:电镜下可见心肌细胞部分肌丝断裂、缺失,肌节挛缩,线粒体肿胀,肌浆网扩张,心肌细胞中凋亡小体显著增多。Nivethetha等用ISO诱导心肌缺血模型,心肌组织病理变化表现为心肌细胞排列稀疏,心肌纤维肿胀、断裂、横纹肌消失;核固缩、破碎甚至消失,间质水肿明显,血管扩张及炎细胞浸润,有灶性出血,甚至有大面积肌溶现象。Mikaelian等发现ISO注射第7天梗死区有胶原纤维沉积,第14天瘢痕形成。注射ISO后的病理变化规律为注射后2h心尖及心内膜即出现变性和水肿,局限于心内膜下的散在点状坏死;注射后4h出现小坏死灶,在心尖、心内膜及血管周围处可见有结构的肌原纤维断裂,并有炎性细胞浸润,形成凝固性肌溶解;注射后1周,可见界限清晰、多发性散在坏死灶,灶内有炎细胞浸润,有胶原沉积和成纤维细胞增生;注射后2~3周坏死病灶面积达到最大,病灶内出现大量的纤维化。4心肌缺血模型Langendorff法为全心缺血模型,利用该模型获得大量的心功能和血流动力学方面的参数。另外,排除了活体神经内分泌因素对心脏的影响,药效易于观察,且给药灵活方便也是该模型的优点。手术结扎冠状动脉左前降支的方法,可造成单纯左心室前壁缺血梗死。此造模方法可研究再灌注损伤,也可以让动物存活,观察药物远期疗效及动态观察缺血再灌注损伤后的发生发展和转归。如Ambler等结扎冠状动脉左前降支30min再灌注2h后连续给硫醇类抗氧化剂4周观察药物对心室重构的影响。该方法的模型既可用于病因病机的研究,也可用于药理药效学的观察。ISO诱导心肌缺血模型的优点是省时、省力、简单易行,不需要特殊设备,多用于药理、药效学的研究,既可预防给药亦可治疗给药。尤其是在研究缺血梗死后的心室重构和心肌纤维化方面有显著优势。Langendorff体外灌注法今后会更多的用来观心肌电生理、冠脉流量、炎症损伤和细胞凋亡等方面的指标改变。手术结扎冠状动脉左前降支法主要会观察心肌