川芎嗪抗血栓作用及机制研究

川芎嗪抗血栓作用及机制研究

高血压的形成是西方国家发病率和死亡率的主要原因。但目前抗血栓药物种类有限,且肝素类多需注射,华法林又需临床监测不能满足临床需求。川芎嗪是从中药川芎根茎中提取的有效成分,具有活血、化瘀、理气功能,扩张小血管和改善微循环的作用,临床上广泛用于治疗缺血性脑血管疾病,并取得较好疗效。国内外文献对川芎嗪的研究主要集中在脑缺血的治疗及体外抗血小板聚集上,未见对在体动静脉血管血栓的报道。本实验旨在研究川芎嗪在体实验动物动静脉血栓模型中抗血栓形成的能力,通过测定抗血小板聚集活性、与凝血酶亲和力和凝血指标凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(APTT),探讨其抗血栓活性并推测其作用机制。1材料和方法1.1医学动物实验中心SD大鼠,雌雄各半,体重200~230g,由中国人民解放军南京军区医学动物实验中心提供,合格证号:SCXK(军)2007-012。家兔40只,雄性,2.0~2.2kg,由南通大学实验动物中心提供,合格证号:SCXK(苏)2008-0010。1.2药物、试剂和仪器川芎嗪,由中国药科大学药物化学教研室提供;二磷酸腺苷(ADP),南京建成生物制品研究所;凝血酶,湖南一格制药有限公司;胶原,Sigma公司;S-2238,Anaspec公司;血塞通片剂,云南玉溪维和制药有限公司;聚桂醇,陕西天宇制药有限公司;PT、APTT测定试剂,太阳生物科技有限公司。1.3仪器、检测方法SC-2000血小板聚集测试仪(北京赛科希德科技发展有限公司);TG1650-WS台式高速离心机(上海卢湘离心机有限公司);小动物血栓生成仪(济南益延科技开发有限公司);BIO-RADModel680全波长酶标仪(上海瑞亿仪器有限公司);半自动凝血分析仪(南京瑞麦科技开发有限公司)。1.4乌拉坦血栓模型的建立健康SD大鼠随机分成5组,分别为正常对照组、血塞通组(80mg/kg)、川芎嗪低中高组(20、40、80mg/kg),每组8只,雌雄各半。连续灌胃给药3d,最后一次给药后1.5h后,腹腔注射乌拉坦(20%,5mL/kg)麻醉。打开腹腔手术结扎大鼠下腔静脉后,缝合腹壁,造大鼠下腔静脉血栓模型,4h后重新打开腹腔,在结扎下方2cm处用止血钳夹住血管,然后纵行剖开管腔观察有无血栓形成,如有即取出血栓,用滤纸沾去血栓表面的浮血,置60℃烤箱烤20h,冷却后称血栓干重。药物对血栓抑制率(%)=(空白组血栓重量-给药组血栓重量)/空白组血栓重量×100%。1.6颈静脉内静脉和面静脉结合家兔分组及给药同前,剂量调整为大鼠剂量的一半。给药后1.5h后,戊巴比妥钠麻醉,右侧股动脉插管。分离颈静脉,暴露颈外静脉和面静脉二分叉处。结扎颈静脉周围小分支血管,动脉夹夹闭两端,保持封闭长度为4cm。面静脉远心段结扎,从面静脉开口,向颈静脉血管中通过灌注0.5%聚乙二醇十二醚(5mg/mL)持续5min。处理后,吸出灌注液,用盐水漂洗。结扎创口。取掉动脉夹重新建立血流量25min后,分离血管片段,取出所有血栓,置60℃烤箱烤20h,冷却后称血栓干重。1.7贫血小板血浆prp和ppp的制备家兔给药后2h,从右侧股动脉插管取血。全血按9∶1加入3.8%枸橼酸钠,混匀,800r/min离心10min,取上清,即为富血小板血浆(PRP);剩余血液继续3000r/min离心10min,得贫血小板血浆(PPP)。用PPP调零,以PRP为血小板供体,每组6个平行样。分别取200μLPRP,与不同浓度的受试药溶液,37℃温育1min后,分别加入ADP、凝血酶、胶原(终浓度分别为10μmol/L、1U/L、4mg/L),利用SC-2000血小板聚集仪描记血小板聚集曲线,记录测定时间内血小板最大聚集率。1.8凝血酶反应tri-0.2mol/l抗凝血酶活性用生色底物S-2238测定。取7.5μL方法“1.7”中制取的PPP和30μL1mmol/LS-2238用87.5μL0.1μmol/LTri-0.2μmol/LNaCl缓冲液(pH=8.4)混合均匀。反应从加入25μL0.1U/mL人凝血酶溶液开始,混合物37℃孵育45min。加入100μL60%乙酸结束反应。吸光度在405nm处测量。抗凝血酶活性(抑制率%)计算方法:抑制率=(1-抑制剂OD值)/生理盐水OD值。1.9测量的父母和孩子1.10pss单因素方差分析实验数据采用均数±标准差表示,多组间比较采用SPSS16.0软件包进行定量资料的单因素方差分析(OneWayANOVA),进一步用q检验比较组间差异。P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1大鼠静脉血栓模型川芎嗪对大鼠及家兔静脉血栓模型均有较好的抑制作用,大鼠静脉血栓模型中,川芎嗪各剂量组与空白组相比差异有统计学意义,而家兔非闭塞性血栓模型中只有高中剂量组与空白组的差异有统计学意义。结果见表1。2.2川评论员对血小板聚集的影响由表2可见,川芎嗪对ADP、凝血酶、胶原诱导的血小板聚集都有抑制作用,且在相同剂量下川芎嗪对ADP,凝血酶诱导的血小板聚集较胶原诱导的血小板聚集抑制效果好。2.3川芎嗪一从高剂量下合成了通血流量的测定,在测定时间内测定总动脉的血流量小川芎嗪能有效地抑制电刺激动脉血栓的形成,且高剂量下川芎嗪在测定时间内的血流量为空白组的1.9倍,较好地提高了通过颈总动脉的血流量。结果见图1。2.4氯乙醇对pt、abt和凝血酶浓度的影响川芎嗪各剂量组对凝血酶均有抑制作用,相同剂量下川芎嗪对凝血酶的抑制率为血塞通的5.8倍,且对PT的延长大于APTT。结果见表3。3川浚嗪的降血作用川芎嗪是伞形科植物川芎中分离提纯的生物碱单体,是中药川芎的主要有效成分,具有扩张血管、增加脑血流量和活血化淤作用。川芎嗪被广泛用于闭塞性脑血管疾病如脑供血不足、脑血栓形成、脑栓塞等。本实验重点从动静脉血栓形成及与凝血相关因子方面考察川芎嗪的抗血栓活性,进一步阐明川芎嗪的抗血栓作用。体内血小板实验中,川芎嗪对ADP、凝血酶和胶原诱导的血小板聚集均有不同程度的抑制作用,且对ADP和凝血酶诱导的血小板聚集抑制作用显著。进一步的凝血酶抑制率实验表明川芎嗪对凝血酶有一定的亲和力,但抑制率较低(40mg/kg时抑制率为18.4%),表明川芎嗪抗血小板聚集的机制除与凝血酶有一定亲和力外还可能有其他途径。大鼠下腔静脉结扎和电刺激以及家兔静脉血栓实验都是从刺激内皮的角度激活凝血通路造成血栓。实验结果表明川芎嗪对以上3种模型均有抑制作用,川芎嗪对大鼠静脉血栓形成的抑制率大于家兔静脉血栓模型,推测可能是由于药物在不同动物体内生物利用度不同导致的。同时川芎嗪对大鼠电刺激动脉血栓形成的作用明显,显著地增加了通过颈总动脉的血流量,由曲线下面积求出川芎嗪在20、40和80mg/kg剂量下18min内血流量分别是空白组的1.3、1.6和1.9倍,较好地改善了大鼠的供血功能。而且川芎嗪对PT的延长效果更加明显,进一步表明川芎嗪抗血栓是通过抑制外源性凝血途径实现的,推测川芎嗪可能是通过保护内皮功能抑制血栓形成的,这也与文献报道的川芎嗪有内皮保护作用一致。综上所述,川芎嗪较好地抑制动静脉血栓的形成,结合凝血酶抑制率、血小板聚集和PT、APTT测定结果,推测川芎嗪抗血栓机制可能与多途径抑制血小板聚集通路与保护内皮有关。1.5时间-颈总血流量图大鼠分组