医学课题开题

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开题报告中性粒细胞诱捕网在支气管肺发育不良的作用及胞外组蛋白拮抗剂对其保护机制探讨

目录研究背景研究内容研究方案预期结果研究背景支气管肺发育不良（BPD）是早产儿尤其是极低出生体重儿最常见的并发症，严重影响其生长发育及生存质量。支气管肺发育不良（BPD）的最新定义[1]：任何氧依赖(>21％)超过28天的新生儿。病理特征：肺泡数量减少，体积增大；肺血管形态改变，微血管发育不良；呼吸道平滑肌轻度增厚，肺纤维化少见2010年NICHD发布的报告显示，2003～2007年美国20个中心出生体重在401～1500g和胎龄在22～28周的早产儿68％患有BPD[2]，轻度27％，中度23％，重度18％。一项中国10个新生儿重症监护室的调查显示，12351个<37周早产儿中1.26％发生BPD，胎龄≤28周的早产儿BPD的发生率为19．3％[3]。发病率高美国中国死亡率高，呼吸系统、循环系统、神经系统都有影响，生长发育受限预后差早产和宫内发育迟缓遗传易感性机械通气高浓度氧营养动脉导管开放（PDA）及室间隔缺损（VSD）感染发病机制和高危因素BPD患儿气管抽吸液中众多炎性标志物证实炎症反应是BPD发生启动的一个中心环节。Landry等[4]在对1192例早产儿的回顾性分析中发现，新生儿肺炎／脓毒症与BPD密切相关(OR1.9，95％CI[1.1～3.2])OR1.9，95％CI[1.1～3.2]新生儿肺炎/脓毒症BPD感染因素在高氧致肺损伤模型中均存在大量中性粒细胞（PMN）浸润及中性粒细胞诱捕网（NETs）过度形成，并通过释放大量细胞因子、蛋白酶等破坏肺泡上皮细胞及内皮细胞，最终引起肺损伤；通过减少PMN及NETs形成可改善肺损伤程度。高氧致肺损伤模型

中性粒细胞

（PMN）中性粒细胞诱捕网（NETs）肺损伤NETs是由PMN释放到胞外的包含有DNA、组蛋白、髓过氧化物酶、中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G的网状结构。Brinkmann等[5]发现，NETs能杀灭病原微生物。而Saffarzadeh等[8]证实组蛋白是NETs发挥作用的关键物质。PMNNETSNDA组蛋白髓过氧化物酶中性粒细胞弹性蛋白酶组织蛋白酶G捕获并杀灭病原菌机体局部出现高浓度NETs，NETs相关效应分子将会导致组织损伤、器官功能失调或衰竭。Saffarzadeh【8】等研究发现NETs可直接导致肺上皮细胞与内皮细胞死亡，其细胞毒性呈剂量依赖性；给予外源性组蛋白，可致肺损伤:肺水肿，肺泡间隔增宽，中性粒细胞浸润，肺出血。[11]而肝肾等器官损伤不明显。[10]PMN/NETS过度动脉粥样硬化、自身免疫性疾病、血管炎、血栓以及肿瘤性、脓毒症囊性肺纤维化、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、急性肺损伤（ALI）/急性呼吸窘迫综合征（ARDS）、肺气肿、输血相关性急性肺损伤可直接导致肺上皮细胞与内皮细胞死亡抗组蛋白抗体可结合血液中循环组蛋白肝素、硫酸乙酰肝素可结合循环组蛋白[12]，肝素因为高度硫酸化而富含负电荷，组蛋白富含带正电荷的精氨酸和赖氨酸，肝素特异性低但高亲和力的静电相互作用可能导致肝素对组蛋白的中和作用。抗组蛋白抗体肝素组蛋白减少改善NETs引起的细胞毒性髓过氧化物酶抑制剂组蛋白是真核生物细胞中染色质的结构蛋白H1、H2A、H2B、H3、H4由细胞凋亡或坏死时染色质发生降解，释放到外周血中产生由PMN释放NETs产生组蛋白引起细胞毒性的作用机制：补体激活细胞外组蛋白的完全释放需C5aR和C5L2受体的参与导致C5a受体破坏作用通过钙离子内流引发了细胞毒性诱导髓过氧化物酶（MPO）

高氧致BPD发病机制中有PMN过度浸润及NETs的过度形成NETs通过胞外组蛋白、髓过氧化物酶等破坏肺泡上皮细胞及血管内皮细胞，使肺发育受阻，最终导致BPD发生。本课题拟通过检测高氧致BPD模型中NETs及胞外组蛋白含量进一步明确其发病机制，并通过胞外组蛋白拮抗剂（抗组蛋白抗体、肝素）阻断胞外组蛋白来破坏NETs结构，从而干扰其对肺泡上皮细胞及血管内皮细胞的破坏作用，最终改善BPD，为BPD发病机制及临床治疗提供一定的理论依据。实验构想高氧致BPD模型NETs胞外组蛋白抗组蛋白抗体肝素破坏治疗BPD研究内容1）建立高氧致BPD模型。2）共聚焦成像技术识别NETs结构。3）检测胞外组蛋白水平。4）通过组蛋白拮抗剂（抗组蛋白抗体、肝素）破坏NETs结构，观察肺组织病理变化。研究方案

新生SD大鼠空气组BPD组BPD+外源性组蛋白BPD+抗组蛋白抗体BPD+肝素组4、7、14、21d评价指标肺组织形态NETs、细胞外组蛋白机制探讨、治疗研究空白对照组①外源性组蛋白：（1）给予8-9周的Wister大鼠注入30mg/kg、50mg/kg、80mg/kg牛胸腺组蛋白，2-24小时观察肺病理，提示肺损伤呈剂量依赖性。[11]，规格：浓度25ug/ml。[12]（2）给予75mg/kg，逐渐出现呼衰、心衰，2小时后死亡。[10]剂量②抗组蛋白抗体：（1）急性肺损伤模型中，小剂量(2．5—5mg／kg)中和抗体保护作用不明显，大剂量中和抗体(10～20mg／kg)可明显降低病死率。[14]（2）给予10mg/kg，可纠正使用相同剂量外源性组蛋白后引起的肺损伤。[10]③肝素、硫酸乙酰肝素:10mg/kg，保护作用；20mg/kg，硫酸乙酰肝素保护作用，肝素加重肺损伤。[13]④人体组蛋白水平：正常中位数2.3ug/ml，四分位数间距0.5-3.6；外伤性肺损伤中位数28.6ug/ml，四分位数间距13.7-58.9ug/ml。组蛋白大于50ug/ml，损伤明显。[10]⑤鼠组蛋白水平：外伤性肺损伤后4小时可达到190ug/ml；[10]剂量1实验动物、器材和试剂动物实验已得到温州医科大学动物管理和应用委员会的许可SD大鼠：雌性16只（体重220-240g），雄性8只（体重300-310g），购自温州医科大学动物实验中心氧箱（规格）、24hHBO-2B型控氧仪（浙江建德梅域电化分析仪器厂）、测氧装置（德国EnviteC-Wismar）、二氧化碳检测仪、电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司检测分度值0.001g）、氧气（购买于欧源气体公司）刀片、组织剪、线剪、镊子、胶布、100ul胰岛素针、10ml注射器、冻存管、EP管、离心机、移液枪、酒精、4%多聚甲醛、水合氯醛、无水氯化钙外源性组蛋白（ug/ml）、抗组蛋白抗体()、组蛋白检测试剂盒(ELISA法)、蛋白定量试剂盒、硫酸乙酰肝素

材料与方法2动物分组和模型制备配鼠：按雌雄比为2:1进行配种，即2只雌鼠与1只雄鼠共同放进一个鼠笼，通过阴道涂片找精子细胞作为雌鼠受孕成功的参考依据。及时清洁鼠笼、补充食物和水。雌鼠约孕3周生产，选取子鼠168只，体重6-8g进行实验分组：空气组（A组）、BPD组（B组）、BPD+外源性组蛋白组（C组）、BPD+抗组蛋白抗体组（D组）、BPD+肝素组（E组）、空白对照组（F组）A、B每组各设3小组，每小组12只，C、D、E、F每组各设2小组，每小组12只

空气组（A组）：置于空气中饲养BPD组（B组）：置于氧箱（91%氧浓度、0.5%二氧化碳浓度）BPD+外源性组蛋白组（C组）：处理方法同BPD组，于生后第四天内眦静脉注射外源性组蛋白BPD+抗组蛋白抗体组（D组）：处理方法同BPD组，于生后第四天内眦静脉注射抗组蛋白抗体BPD+肝素组（E组）：处理方法同BPD组，于生后第四天内眦静脉注射肝素空白对照组（F组）：处理方法同BPD组，于生后第四天内眦静脉注射非特异性IgG氧箱内母鼠需每天更换代乳母鼠，防治母鼠氧中毒

A组、B组生后第4、7、10、14、21天，每次取6只鼠的血标本、肺标本；C、D、E、F组第7、10、14、21天，每次取6只鼠血标本、肺标本；予4%水合氯醛腹腔注射麻醉，用100ul针颈静脉取血，5000r/min离心10min，留取上清液,置于4℃冰箱保存；取肺标本，3只10%多聚甲醛肺灌注后置于盛有多聚甲醛液的EP管内，置于4℃冰箱保存；3只取肺取后于冻存管，置于-80℃冰箱保存。

标本留取及保存方法动物一般状态：毛发颜色、呼吸、精神及反应。死亡及生长情况：死亡率、死亡时间、体重增长等。肺组织形态学观察不同组肺组织病理变化：取自小鼠左肺叶的组织浸泡在10％甲醛溶液中24h，用石蜡包埋，乙醇梯度脱水，切成4um的切片，采用HE染色后于光镜下观察肺组织形态。RAC（放射肺泡计数）：自终末细支气管中心到最近的纤维隔或肺边缘作垂直线，该线上的肺泡个数。

计划观察指标共聚焦成像技术识别NETs结构：分别用中性粒细胞弹性蛋白酶抗体、DAPI及组蛋白H1抗体进行免疫组化染色，并采用共聚焦成像技术观察NETs结构。检测胞外组蛋白水平：以ELISA法检测SD大鼠外周血胞外组蛋白水平变化，主要是H3、