双向电泳实验

双向电泳

基因组学与蛋白质组学基因组学：蛋白质组学：可视为分子生物学的大规模筛选技术，目的在于归类细胞中的蛋白质的整体分布，鉴定并分析感兴趣的个别蛋白，最终阐明它们的关系与功能。上述两种学科的研究内容在互补的水平上研究了细胞的分子架构，又都在各自的水平上提供了增强对方效应的信息，因此二者存在有很强的且带有系统性相互关系。Applicationsofproteomics•

Proteinidentification/characterization•Protein-proteininteraction•Post-translationalmodifications•Subcellularlocation•Elucidationofpathway•Targetvalidationandtoxicology•Drugdiscovery蛋白质组分析的首要要求将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析。2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术。生物学问题的提出实验模型的设计实验组和对照组样品的制备蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离图像扫描和初步分析感兴趣蛋白点的切取胰酶对脱色后蛋白质的消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对新蛋白质的发现其它实验的进一步验证蛋白信息的初步获得蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质样品的制备双向电泳图像分析转印至膜上的蛋白凝胶中的蛋白溶液中的蛋白混合肽蛋白质质量N端测序肽序列质谱数据肽指纹图数据搜索新的或已知蛋白蛋白转录后修饰的鉴定一、样品制备制备的一般原则：尽可能提高蛋白样品的溶解度（包括多数疏水性蛋白），抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；且制备方法应具有可重现性。（最关键因素）减少对蛋白质的人为修饰（如酶性或化学性降解等）。完全去除样品中的核酸。（超声、核酸酶）尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。增加样品溶解性的手段1、变性剂：将蛋白疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和硫脲。2、表面活性剂：经变性剂处理后用来溶解疏水基团。常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂TritonX-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。3、还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自由巯基的DTT或

-巯基乙醇，以及不带电荷的磷酸三丁酯（TBP）进行还原。4、起载体作用的两性电解质：某些蛋白质需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。Carrierampholytes的作用在于捕获样品中的少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性。应用时，两性电解质的浓度应小于0.2％（w/v)。浓度过高会使IEF的速度降低。另外，为了保证实验的精确性，在选择不同pH范围的IPG胶条时，也应使两性电解质的pH值与之相符合。可溶性样品

固体组织样品

细胞不同样品的基本处理方法不同样品的分级处理通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法对蛋白质样品进行分级处理，可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分级抽提，按样品溶解度不同进行分离。常用细胞裂解液ReagentFinalconcentrationurea7MThiourea2MCHAPS4%Pharmalyte0.2%(临用前加)DTT40mM(临用前加)混合酶抑制剂特殊样品的制备低丰度蛋白的分离：尽管增加上样量和提高总蛋白的溶解度能增加分离时的低丰度蛋白的量，但同时增加了高丰度蛋白的负荷，且造成蛋白的叠加效应而影响分离。现常用预分级＋窄pH胶的微制备技术进行分离：即将总蛋白组分成蛋白质组亚群，再用pH梯度小于2个pH单位的IPG胶进行窄pH范围的分离。

强碱性蛋白质（如核糖体）的处理：先将蛋白预处理以富集，再用特殊pH梯度的IPG胶条（如pH3－12、4-12或10-12）进行等电聚焦。其中窄范围碱性IPG胶（如pH10-12）的挑战是克服反向、阴极向阳极、电渗流和水平条纹模式，而宽范围的碱性IPG胶（如pH3-12、4-12）等消除了窄范围胶所需要的专门水化液。极端分子量的蛋白质：小于8kD和大于200kD的蛋白在常规IPG-2D上不易看到，这可能是在Tris/glycine缓冲液中，样品和游离的dodelcylsulfateions持续积累浓缩，与小分子量的蛋白质发生对流混合，产生茸毛状的或模糊的带，从而降低小蛋白的分辨率；在胶底端，高浓度的十二磺酸使蛋白固定致染色困难。至于高分子量蛋白少的原因可能是在变性条件下，蛋白质复合物变成了多肽，或者可能是大分子。二、一维固相pH梯度等电聚焦

（IEFwithIPG）IPG胶的材料是Immobilines，为拥有CH2=CH-CO-NH-R结构的8种丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基团，它们构成了分布在pH3~10不同值的缓冲体系。根据公布的配方计算后，将适宜的IPG试剂添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通过这种方式生成的IPG不会发生电渗透作用，因而可以进行特别稳定的IEF分离达到真正的平衡状态。IPG胶条的重泡胀泡胀的实质：是让样品能完全以可溶性的形式进入IPG内，从而能进行接下来的IEF。蛋白载样量影响IPG胶条对蛋白载样量的因素包括：待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析。电泳的目的：如果只是得到一张好的图片，则无需考虑太多其它因素。待研究蛋白的丰度：样品的复杂度：复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能完成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。IPG胶条的pH范围：IPG胶条的蛋白质大约载样量IPGStriplengthAnalyticalLoad(silverstaining)PreparativeLoad(Coomstaining)7cm10~100

g/125

l200~500ug/125

l11cm50~200

g/185

l250~1000ug/185

l17cm100~300

g/300

l1~3mg/300

lIPGIEF中pH梯度的选择

常用方法：先宽后窄，先线性后非线性，先短后长，预试验确定。预分步收集细胞浆细胞核细胞膜核糖体及其他特定细胞成份细胞分泌成份pH4-12pH3-10pH4-7pH5-8pH7-10pH6-11pH3-6pH3-4pH4-5pH5-6pH6-7pH7-8pH8-9pH9-10pH10-11pH11-12第一步第二步第三步用窄pH范围阵列分离低丰度或交叉覆盖蛋白阵列那些亚细胞定位位置的功能蛋白质亚蛋白质组阵列策略的框架图3倍3倍聚焦时间的优化

理论上讲，要获得最好的图谱质量和重复性所需最佳时间是IEF分离达到稳定态所需的时间。聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现。过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会因为活性水转运而导致过多水在IPG胶表面渗出（电渗）而造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。最佳时间的确定需要根据不同蛋白样品、上样量、pH范围和胶条长度通过经验来确定。IEF的基本条件Stemp1Stemp2Stemp3totalvoltageTimeVolt-HoursRamp25020min－－－Linear400040002hr－－－－－－10,000V-hrLinearRapid5hr14,000V-hr7cmStemp1Stemp2Stemp3totaltotalStemp1Stemp2Stemp311cm17cm25025080001000010000800020min20min2.5hr2.5hr－－－－－－－－－－－－－－－－－－20,000V-hr40,000V-hr～30,000V-hr～50,000V-hr5.3hr7hrLinearLinearLinearLinearRapidRapid三、两维间的平衡

一维结束后可马上进行二维电泳，也可保存在两片塑料膜间于－80°保存数月。但在二维电泳前一定要进行胶条的平衡，以便于被分离的蛋白质与SDS完整结合，从而在SDS是电泳能顺利进行。建议方案是：用含2%(m/v)SDS、1%(m/v)DTT、6mM尿素和30%甘油的50mMTris（pH8.8）缓冲液先平衡15min，再用5%(m/v)碘乙酰胺取代DTT后的上述缓冲液平衡15min。四、二维SDS同普通SDS类似。但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶，因为在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓缩，可以认为非限制性IEF胶（低浓度丙烯酰胺胶）充当了浓缩胶。聚丙烯酰胺凝胶和转印到膜上的蛋白质的检测理想显色剂的7S安全（safety）：灵敏（sensitivity）：简单（simplicity）：特异性（specificity）：快速（speed）：稳定（stability）：兼容性（synergy）：五、有机染料和银染考染灵敏度为30~100ng，线性范围是20倍；银染的线性范围是40倍，灵敏度是考染的100倍。胶体考马斯亮蓝染色技术可实现PAGE的无背景