WesternBlot实战指南：从电泳到定量

【转】WesternBlot实战指南：从电泳到定量-1样品制备：变性条件——SDSLB直接裂解：〔遗忘，LB久煮某些性质会转变〕的1*SDSLB〔或者略高1.5*〕直接加到细胞或者组织上并煮样。通常6孔板细胞80%以上密度，需200ul，其他按平板面积比类推。通常条件下，SDSLB都是过量的〔因此不肯定要严格参考SDSLB稀释比〕；SDSLB不够，样品核酸、蛋白浓度过高时，煮样后会觉察tip吸不上来，格外粘、一砣一砣的，很简洁堵住tip。这时候常规做法有两种，1.再煮5min。常规煮样时间3-5min，样品过浓时就煮10min；2.假设10min煮样后，仍旧吸不起来，才适当增加SDSLB，连续煮；也可以对样品进展超声。煮样时间假设过长，蛋白会凝固，此时以失去连续WB〔推断标准：消灭明显的蛋白沉淀和水分层〕此方法的缺点，SDSLB煮过的样品假设用来做IP，需要特别方法，因此，这种制备方法制备的样品有使用局限。〕裂解细胞请尽量冰上操作，减缓酶解作用。bossnature文章上的裂解液配方是：20mMTris/HCl,pH7.6,100mMNaCl,20mMKCl,1.5mMMgCl2,0.5%NP-40andproteaseinhibitors(20μg/mlleupeptin,10μg/mlpepstatinAand10μg/mlaprotinin)〔此裂解液可用于抽提核蛋白〕，其中0.5mMPMSF1mMNa3VO4〔现加现用mMNaF,1mMNa3VO4,50mMbeta-GP。此方法的优点：NaClIP等试验。其他Na0.15M〔生理格外粘稠〕及0.8-1.2M；0.3M及以下适合IP试验，0.6M及以上适合纯化蛋白，的高盐裂解细胞。用于核蛋白的裂解的缘由是0.5%NP-40，用于破坏核膜构造；可用到1%，但此组织块裂解：组织块较大用匀浆的方法最适宜，现在有不少转头很小的匀浆器。50mg颖癌组织，我承受的方法是低温〔剪〕搅碎，成肉糜状。〔进一步裂开；反复屡次。用上述细胞裂解液回收。分泌型蛋白富集：用无血清培育基培育细胞，收集上清液用于WBTCA沉淀富集。的试验条件；但是这存在隐忧。由于含血清的培育基中含有格外丰富的BSA〔牛血清白蛋白〕之类的蛋白质，除非你进一步分别纯化，否则直接用这种样品WB60-46kDa浓度过于富集，会非特异性粘附“任意”抗体，从而最终被识别。同理，SDSLBPBS基中的BSA。〔可能激活未知信号途径，诸如AKT等〕，还会消灭的问题是：即使承受了无血清收集上清，仍旧有大量杂蛋白，但相对好很多。选用了上清，由于蛋白浓度太稀，通常要承受TCAa.TCA尤其在离心过程，离心管的摆放格外讲究，要180度翻转离心两次。b。重溶解时，由于蛋白需要在肯定的盐离子条件下才能重溶解，你要摸索充分溶解的条件，相对麻烦。WBcancercell文章所争论的蛋白就是分泌型蛋白，但90%的数据是celllysis；间或用到上清，也只是作为富集纯化该蛋白的原料，为进一步分析做预备。样品冻融会存在另一个问题，SDS沉淀；SDS4度就会沉淀，何况-80度。上样样品制备完，应马上低温保存〔-20度短期〔几天〕；-80度长期；例外，IP用样品冻融会存在另一个问题，SDS沉淀；SDS4度就会沉淀，何况-80度。上样前应加热充分溶解，否则从加样口向下拖带〔SDS前应加热充分溶解，否则从加样口向下拖带〔SDSLB不够，样品未充分溶解也会消灭类似拖尾；上样过大也会〕。定量问题；WB20%，太微小的差异常常无视不计。细胞样品可WB开头，裂解液的体积都是准确定量的，操作定量的不科学性，以及裂解液成分对定量的干扰。蛋白电泳：电泳胶的制备、配方、缓冲液配方，请参考分子克隆。阅历之谈，8%胶最底边36KDa，10%最底边约25KDa，12%最底部约12KDa。8%胶可以跑300KDa-36KDaWB12%，180KDaWB〔300KDa有尝试过〕。电泳一般承受恒流，45mA-55mA〔应依据电泳仪器适当调整，要留意仪器最高限压；此条件适合gibcomodelV16型，胶宽20cm〕。承受恒流的优点，保证最〔电压会渐渐增大留意事项：聚丙烯酰胺的30%母液会降解，要4度避光保存。APS会失效，10%APS一般保质期才一个月左右。-20扭曲、变形。TrisbuffPHPHPH〔即便在分别胶中〔溴酚蓝此时涌动极缓慢，位于胶中上部〕4．上下层式电泳装臵假设漏液，哪边漏液，电泳条带往哪边倾斜。内外式电泳装扭曲、变形。配胶用玻璃板和边条应准时洗净。玻板未洗净的害处很多。尽管玻璃看似平滑，但是一些微小的凹陷处会分散肉眼无法区分的胶颗粒〔摸上去疙疙瘩瘩〕，RNA的超薄胶，胶板的颗粒会导致局部巨大气泡，格外难于去除〔夹在玻板和胶之间，〔比水更好，有SDS润滑〕。推断玻板是否洗干净，用手摸一下有没有疙疙瘩瘩的；最好用洗洁精之类，洗衣粉、肥皂都不好用。tip〔或者承受细的尖端拉长的专用上样枪头SDSLB平衡，否则最外侧条带会拉宽变形。通常20ul样品〔含5ul4*SDSLB〕，可用8-8.5ul4*SDSLB平衡。同理，点marker的lane也要参加同样体积的LBLB假设在室温放臵太久和颖的在比重上会有差异，LB空白所用LB应全都。LB应-20度保存。8．增加上样量不肯定会提高荧光信号强度。增加上样量的后果通常只能是让你的内WB10IP富集〕荧光灼烧式粹灭〔一晃而灭〕或者条带中空。680SDSLB200ul〔最少80ul，这样面积的培育板假设裂解液投入太少，回收时的损失就太大，上样就很难做到全都5-6ul，最少2.5ul10ul10ul固然并非不行以多上样，再多对WB〔没有的仍旧没有都很丑。IP15ul，刚好+5ul4*SDSLB20ul8点提到只上5ul+5ulSDSL〔“空白”泳道隔开〔空白仅指无蛋白，仍应参加8-8.5ul4*SDSLB〕，这样才能确保每条带都很美观。SDS胶配好临时不用时，需用电泳缓冲液灌满空间〔拔去梳子和底边两种方案都可以。所以假设估量次日工作量较大，可以提前灌好SDS。样品是否肯定需要定量再上样？——不是的，这是铺张时间的一个操作。我们首先来争论一下蛋白定量的科学性。蛋白定量首先需要一个参照系〔标准蛋白BSA的浓度的一个参照值。这里面存在一个问题，即无视响颜料分子的嵌入。因此你其实默认将全部的蛋白等同于BSA在溶液中的折叠还不算上测量误差等等，就已经很不准确了。CoomassieG250Bradford法〔实际也是Coomassie染色〕显色，尤其是去污剂之类；例如NP40，就会使Coomassie显蓝色，可以完全掩盖掉蛋白与Coomassie作用产生的蓝色。因此，假设你的裂解液里面含有这类物质，所谓的蛋白定量实际是NP40颜色和蛋白染色的叠加，根本不会符合标准蛋白曲线的线性规律，自然定不准。NP40会这样，由于我们从来不去定量，没有做过更深入的争论。】连、不会过曝光。从而在其次轮跑正式结果前，依据第一轮的内参的荧光信号做微调，大致能做到相当；最多可能需要第三轮。以上的试验可以准确到0.1ul差〔的蛋白让你去定量WB丰富的师兄师姐或者导师帮助。QuantityOne等定量软件对光密度定量后计算差异从而调整上样体积是否可以？——不行以。由于WB量仍会消灭偏差。去除可能影响对组织蛋白的提取。所以这是一个两难的问题。WBWB别力量的强弱，以及如何正确使用抗体，这个问题下节争论。有一个简洁的例证，Biorad供给的3mm想〔从预染的marker〕，但对多数一般丰度的蛋白的检测没有任何影〕。没有很好的策略可以解决这个滤纸的问题；尝试过浸泡〔会泡烂的〕、预电泳〔会略微好点〔晾干再用；只要没冲烂可以始终反复使用。下仍会深入探讨如何提高转膜效率。针对提高转膜的效率，个人认为最先应当考虑到的是仪器的选用。这里不是卑视“madeinChina”，国内的厂家很少留意不断提高自己产品的品质，走低端策略，对于电泳仪这种技术含量不高的仪器倒可以凑合；但说到转膜仪，〔极之间场强更加均匀，那种大块金属板外表是镀过极薄的白金层〕；因此转膜效率和均匀方面孰优孰劣不言而喻。目前，个人使用过的国产电转槽〔湿转〕唯Tanon仿Biorad的还可以〔算替它们免费打个广告吧，Tanon仿bioradmini3型电泳仪，在某些方面〔主要是操作〕上还优于Biorad原装；目前我认为“中国Bioradamersham和英国公司的scie－plas。碎裂不得不报废该仪器〔致仪器报废——我们先后买过33Biorad有没有改进这个问题；假设没有，我想市场迟早会被其他公司所取〔不如湿转，但抗体好、蛋白丰度一般时仍可承受〕长时程〔3hrs〕转膜需要在4coldroom有代理，但质量和散热都格外好。这里谈到了半干转和湿转。这两种转印方法各有优劣。湿转适合全部的蛋白，转膜效率最正确，但靡费试剂、溶液，对一般分子量大小的蛋白转染操作时间长于半干转〔下文会具体给出条件〕；半干转适合分子量较小的蛋白，省时、省试剂。蛋白分子大小如何界定呢？习惯上认为150KDa白，固然这只是一个相对标准。因此，通常对大蛋白的转印多数人会选择长时程的湿转，那么刚刚提到的amersham时转膜效率是否更高已经没有任何意义——我说过转印效率对WB打算因素。〔<=5次常规1hr3hrs〕，不过要留意初始电〔可开头或中途更换颖转膜液〕。电转液中SDS增加蛋白的水溶性，促进蛋白在电转液中泳动。假设不加SDS，蛋白会沉淀在胶上，但SDS过多会影响蛋白与膜的吸附。甲醇能使SDS与蛋白分别，甲醇浓度越高SDS与蛋白分别越快，但浓度为20%，但PVDFmarker上交联的小分子颜料的力量很差，可考虑白转印可考虑降低甲醇浓度，另外SDS必需添加。甲醇的另一个作用是降温，少量补加。湿转一般承受稳压，电压掌握在120-140V，时长1-3hrs〔小蛋白掌握在1hr，大有多大程度的增益难说，不太推举；半干转一般稳流，依milliporePVDF2.5-3mA/cm225〔biorad半干仪额定值不能超过25Vamersham假设是3mA/cm2，时间不要超过0.5hr。这两款仪器的限压要求，可能出于保护仪器的目的；amersham>30V，～35V四周的时候，保险会自动跳掉、切断电转仪电源。至于UK3hr以后，18V〔因此足见其散热性能的优良〕。注明：以上半干转仪时间的PVDFNC膜对蛋白的截留更高〔但NC所以通常同样使用TBST这种低盐洗液背景比PVDFPVDF子的截留明显不如NCmarker上的颜料小分子很简洁穿过PVDF〔除可考虑提升甲醇浓度至25%外，也可以考虑增加marker的上样量〕；NC膜没有这种问题，所以通常它的转膜时间也是小蛋大胶300mA，假设胶面2.5-3mA/cm2左右NC膜唯一不如PVDFNC成分涂在另一种介质的外表，这种膜的支持强度和PVDFNC特别留意正反面。此外，20KDa以下的蛋白宜承受0.22uM孔径的转印膜，但也不是肯定必需。对于大蛋白转印，很多书本建议承受低浓度胶，如6%SDS-。但实际操作觉察，6Actin、tubulin45KDa6%胶底边溴酚蓝指示60KDa灌不同浓度的胶或者梯度胶，否则需要同时跑两块胶，因此也不是很推举。个人阅历认为300KDa以下8%〔底边36KDa7-8%胶可以兼顾内参和大蛋白。〔高温会局部溶胶或降低转膜效率件建议湿转、半干转均在低温〔4〕进展。此外，湿转缓冲液可以考虑转印前臵-80度预冷。〔压〕和膜之间的间距是数十万倍计的，因此更严密的接触无疑是转膜成败的关键。〔可以削减与滤纸或者膜之间的气泡些缓冲液会有利于削减气泡〔PVDF要先用甲醇潮湿再投入缓冲液；NC缓冲液〕。如何监控转膜的效率呢？〔也包括考染胶〕HRP-ECLWB〔考染胶无颜色也不能说明转膜充分了，承受更直观的预染marker〔marker〕PVDF〔颜料与蛋白交联得过深会使整个lane〔多可转变NC膜；要么承受上面提到的格外稳定的转膜条件、留意必要的细节，就可从根本上无视掉其对转膜效率的指示，而把预染的marker仅仅作为一个分子量大小〔没有插反电极，放反膜〕，也可为后续抗体孵育操作时膜的正反面做必要的提示。不同公司预染的markerNEB和invitrogenmarker要上8-10ul，MBI的只要5ul〔20×30cm〕，Biorad－mini3型〔8.2×7.4cm)MBI最低2.5ul转膜后就足够清楚。抗体孵育——WB真正的难点：抗体的使用是一种艺术，一种抗体一个脾气。对WB求特异性和非特异性背景之间差异的最大化。封闭最短可以缩减到5min：很多人把高背景或者黑板，认定为封闭不充分，其实这也是没有吃透WB〔说实〔极端点〕也是个可有可无的步骤，真正对降低背景起核心作用的是抗体稀释液中的组分。其实封闭最短可以缩减到5min〔没试过更短的，不肯定不行以〕。那什么导致〔主因〕，或者抗体稀释液的配方有问题〔增大抗体稀释比略微有所改善〕。封闭液的配方可以和抗体稀释液一样，也可封闭很少出状况。不过在milk做封闭剂的封闭液中，milk微小的颗粒会粘附在膜上增加星点状背景。TBST参差不齐。各家生产的抗体中质量问题最严峻的是scbt的抗体，但它们的价格却是最廉价的。其实，scbt一种抗体〕，ProAbeads之类的，所以不惊异它的普及率；sigmaAbcom、R&DSigmaActin，cat.A5316，cloneAC-74，Mab1：30,000稀释〔是一般一抗效价的30〕。此外，尽管cellsignaling时，我们会刻意避开购置cellsignaling的产品，诸如Akt总抗和Ser473〔这两种R&D的产品效价不错〕。〔特别注明：前几年CST的AKT抗体识别的条带在55KDa左右，而其他公司抗体〔包括磷酸化〕已经被CST自己下架了，