免疫定性试验结果判读

临床免疫定性试验结果判读泗阳县人民医院周育洋boatman7799@

今天的复习题1、简述实验室选择免疫定性检测敏感性、特异性、预测值、符合率的原则，并举例说明。2、简述丙肝抗体检测实验室诊断流程。3、简述造成RPR试验假阳性的一部分原因。本课件免疫定性试验仅指临床通常使用的基于抗原-抗体反应原理的试验抗原-抗体反应的特点：*特异性*比例性前带（抗体多）后带（抗原多）*可逆性pH离子强度抗原抗体反应类型沉淀反应可溶性抗原凝集反应颗粒性抗原补体参于的反应中和反应标记免疫荧光放射

酶标发光金标

影响抗原-抗体反应的因素反应物自身的因素：抗原：可溶性颗粒性细菌细胞抗体：来源浓度特异性亲和力反应环境条件：电解质酸碱度温度

原材料-决定性抗原类型：天然（自然生成，未经修饰）变性（或在其它方面改变）合成（用片段和甚至是单独的表位）纯度：用于纯化的方法应尽可能的精密。为了允许较小组分的检测，应该有足够的量亚型：全面性突变：抗原性改变影响因素原材料抗体类型：单克隆、混合单克隆、多克隆或单克隆-多克隆组合。非特异活性：可以来自“异常”人免疫球蛋白，包括风湿因子和异嗜性抗体（抗-反刍类、抗-鸟类或抗-鼠类）。效价：最佳反应的工作稀释度。推荐的稀释度应该只作为起始点被接受。内源性干扰因素

类风湿因子、补体、异嗜性抗体、治疗性抗体、自身抗体、溶菌酶、磷脂、药物小分子、总蛋白浓度等。类风湿因子（RF）干扰RF一般为IgM型，亦有IgG和IgA型。RF具有与变性IgG产生非特异结合的特点。在捕获法IgM型特异抗体的测定中表现最为明显，因为此时固相包被的抗体为抗人µ链抗体，IgM型RF的存在可使其大量结合于固相。类风湿因子干扰的排除稀释标本改变标记抗体用变性IgG预先封闭标本中RF测抗原,可加入还原剂如2-巯基乙醇去除RF使用特异的鸡抗体IgY作为标记或固相抗体补体干扰固相抗体和标记二抗的抗体分子可发生变构，从而其Fc段的补体C1q结合位点被暴露出来，这样C1q就成为一个中介物将二者交联起来，从而出现假阳性结果。固相抗体也会因为活化补体的结合，封闭抗体的抗原表位结合能力，而引起假阴性结果或结果偏低。

补体干扰的排除56℃30min加热可使标本中补体C1q灭活使用特异的鸡抗体IgY作为标记或固相抗体自身抗体干扰自身抗体如抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等，能与其相应靶抗原结合形成复合物，在免疫测定方法中可干扰相应抗原抗体的测定。为避免以上情况出现，可在测定前用理化方法将其解离。

影响因素--反应模式双抗体（原）夹心法间接法竞争法竞争中和法捕获法一步法的增强试剂聚乙二醇，用来增强抗原-抗体复合物的生成，加速非特异性绑定和反应时间，但可以引起非免疫化学沉淀，降低试验的敏感性和特异性。液液相技术固液相技术二步法影响因素--信号放大系统显色剂：OPD，TMB荧光：4-MUP时间分辨：稀土元素化学发光：鲁米诺，吖啶酯类，AMPPD电化学发光：三甲基吡啶钌外源性干扰因素溶血、细菌污染、标本贮存时间过长、凝固不全、反复冻融。标本溶血注意避免出现严重溶血。血红蛋白类似过氧化物的活性，使反应显色。标本被细菌污染细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用。细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。

标本贮存时间过长标本在2～8℃下保存时间过长，IgG可聚合成多聚体，在间接法免疫测定中会导致本底过深、甚至造成假阳性。血清标本如是以无菌操作分离，则可以在2～8℃下保存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长时间保存，应在－70℃以下。

标本凝固不全血液采集后，离心分离血清没有完全凝固，离出的“血清”并非为完全的血清，其中仍残留部分纤维蛋白原，易造成假阳性结果。血液标本采集后，应使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。冰冻保存标本避免反复冻融反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。几个统计学概念

正态分布(Gaussiandistribution)当一质控物用同一方法在不同的时间重复多次测定，且测定数据足够多时，如以横轴表示测定值，纵轴表示在大量测定中相应测定值的个数，则可得到一个两头低，中间高，中为所有测定值的均值，左右对称的“钟形”曲线，亦即正态分布，又称高斯分布。正态分布的基本统计学含义可用均数（X）、标准差（s）和概率来说明。重复性条件是指在短的间隔时间内，在同一实验室对相同的测定项目使用同一方法和同一仪器设备，由相同的操作者获得独立的测定结果的条件。诊断敏感性（sensitivityofdiagnosis）

是指将实际患病者正确地判断为阳性（真阳性）的百分率。阳性预测值（positivepredictivevalue,PPV）

是指特定试验方法测定得到的阳性结果中真阳性的比率诊断特异性（specificityofdiagnosis）

是指将实际无病者正确地判断为阴性（真阴性）的百分率。阴性预示值(negativepredictivevalue,NPV)

是指特定试验方法测定得到的阴性结果中真阴性的比率。诊断效率

（efficiencyofdiagnosis）是指能准确区分患者和非患者的能力。理想测定方法的诊断效率应为100%。临床免疫检测类型定量分析：确定被分析物的含量。产生一个与待测分析物的浓度相关的光谱信号，如果有已知浓度的分析物制剂做校准，分析物的实际浓度就可以被确定。定性分析只关注分析物的有或无，而不关心有多少（定量）。又分为用肉眼和经验判断结果的纯定性试验和用读数仪根据CUTOFF值或域值判定结果的量值化定性试验。阳性结果只说明分析信号超过了分析阈值（检测限）或cut-off值（cut-off值的设定给出了简要的敏感性和特异性组合）。一般针对感染原和来自天然感染或免疫接种的相关抗体的相关检测。定性免疫检验方法较多，主要有沉淀试验、凝集试验、荧光免疫试验、酶免疫试验和金标法。其中金标法虽然是灵敏、特异、快速、简便、准确率较高的体外诊断方法。但是仍存在不足之处，易出现假阳性和假阴性，尤其是国产的金标试剂，所以建议采用ELISA法。定性免疫检测的用途筛选试验用来检测全体人群或人群亚群一个特征的出现（如感染原或相关抗体的出现）。一般要求趋向二个极端：要么有高的临床敏感性（即超过95%的临床检出率），检测结果保证阴性筛选结果具有高可能性的没有这些特征，而阳性结果可能需要做进一步的确证试验；血站系统的传染病筛查属于此类。要么有高的特异性，检测结果保证阳性筛选结果具有高可能性的具有这些特征。诊断试验用来评价具有可疑给予特征（如一种感染的特殊类型）的人。敏感性和特异性应该处于相对平衡状态。如果此特征对治疗或预后考虑很重要，那么敏感性要尽可能的高；而且后续已有准确的确证试验，可以不需要高的特异性。感染性疾病的大多数临床试验是用于诊断。

确证试验

获得筛选或诊断试验阳性结果后，增加的试验用于证明和确认此人前面的阳性结果。在这种情况下，主要考虑的性能常常是特异性和阳性预测值，而不是敏感性和阴性预测值；特异性应该超过98到99%。确证试验可以是非免疫化学的（如，培养或脱氧核糖核酸研究）或免疫化学的（包括免疫印迹和抗原或抗体中和试验）。如果筛选和诊断试验已具有高的特异性和阳性预测值，则不需要确证试验。定性免疫检验质量控制

已知的弱阳性质控:每次测定都应至少带一个已知的弱阳性对照，从而有助于判断临床标本的检测结果是否有效。阴性质控:必需

每次测定都必须设空白对照、阴性对照、阳性对照和弱阳性对照。

CUTOFF值的选择一个试验一般不可能有完全的（100%）敏感性、特异性或预测值。Cutoff值的选择和来自一个检测的结果报告，应该考虑以下这些性能指标哪个更重要：（1）当疾病是严重并且可治疗的，应该不能漏检；假阳性结果不会导致严重的精神或经济创伤；不合适的治疗仅有轻微的后果需要高敏感性。（2）当疾病是严重的但是不能治疗；没有疾病时具有心理或公众健康价值；假阳性结果可能引起严重的精神或经济上的创伤（如HIV抗体的确证试验）需要高特异性。（3）当不合适的治疗可能导致严重后果，需要高预测值。（4）当疾病严重但是可治疗，并且假阴性或假阳性结果同样严重（如引起脑膜炎细菌抗原的分析）需要高符合率。在确定这些因素的合适平衡点时，厂商或其它检测的研发者应该用来自三种人群的样本评估检测的性能：感染疾病的人，没有疾病的健康人和非讨论疾病患者的病人。厂商应该标明推荐的cut-off值是怎么定义的以及在什么样的人群应用。理想状态，实验室应该在自己的服务人群中确定区间和cut-off值。纯定性试验的质控要求

临床免疫纯定性试验大都属于CLIA’88豁免的技术（waivedtestingsites），包括免疫沉淀、凝集试验、标记免疫的金标试纸和斑点渗滤、免疫荧光印迹法等等。对于FDA等批准家庭使用的技术，只要求检测装置有内对照，检测结果满足说明书规定即可；对于需要经验来判定结果的技术仍需在实验室进行，均有质控的要求，但国际上无具体操作的规定和资料。根据显色或发光直接判定阴阳性的技术，如金标试纸，美国CDC在“CLIA’88豁免的HIV抗体快速检测的质量保证指南<2007年版>”中要求：除检测装置的内对照外，每检测日或分析批，应使用弱阳性和阴性外对照作为质控。无判定标准，一般理解为阴、阳性质控的检测结果分别为阴性和阳性即表明在控，相反则为失控。根据滴度或稀释度判定阴阳性的技术，如凝集试验，使用弱阳性和阴性外对照质控，阳性质控结果在均值上下一个滴度或稀释度以及阴性质控结果为阴性即为在控，否则视为失控。失控原因分析

失控信号的出现受多种因素的影响，包括质控物、试剂、仪器、操作以及质控规则本身等等。一旦出现失控信号，实验室应该仔细地分析原因、查找根源，不要拘泥于推荐的程式化的步骤进行，而应该根据误差的来源和当批工作的实际开展排查工作。偶然误差造成的失控，首先考虑有无工作条件的变化，如新的质控物、新的试剂、仪器故障、人员变动、操作程序变化等等；其次查找仪器校准、环境因素（水质、温湿度）等原因。系统误差造成的失控，首先考虑质控物或试剂原因，其次查找仪器校准问题，再次分析操作程序、环境因素等原因。失控处理

实验室在确定失控原因后，应有针对性地采取纠正措施；对重复或系统性出现的失控原因需引入预防措施，必要时还应修改程序文件或作业指导书。对于失控批的患者标本应根据不同情况采取相应的重测方案：阳性失控，重测所有阴性标本；阴性失控，重测所有阳性标本。判读实例（1）梅毒试验的实验室检查TPTreponemapalidumsubsp.palidum苍白密螺旋体苍白亚种梅毒(syphilis)是一种疾病，我们只是做相关的实验室检查，对结果的解释必须结合病史和患者的临床情况。现实意义梅毒感染率逐年增加，2005年在所有甲乙类传染病仅次于肺结核、乙型肝炎、痢疾、淋病居第五位。和艾滋病、淋病、肺结核等呈复合感染。梅毒感染率逐年增加，不容忽视假阳性率也很高阳性率：大样本输血员0.58%低危人群（病员）1.52%~1.61%

其中﹥50岁者占53.3%~62.3%阳性率3.02%~3.15%我们怎么应答：供血与受血者，手术，创伤性检查，院内感染控制。（婚检）必查项目。实验室诊断（病原体1）DFM暗视野显微镜找Tp：病灶组织液、肿大淋巴结穿刺液。§Tp呈白色发光，运动快速，开塞钻样旋转。§单次阳性率＜50%，多灶取样，连续检查。§注意安全防护。实验室诊断（病原体2）DFAT直接荧光抗体检查Tp：§病灶组织液、肿大淋巴结穿刺液。涂片、干燥、丙酮固定。§FITC─抗Tp单抗染色，荧光显微镜检查。§注意安全保护。实验室诊断（病原体3）PCR核酸检查：敏感性差异大，不能区分T.pallidum亚种。已建立一些新方法（如MGB-TaqMan探针荧光定量PCR），需广泛验证。实验室诊断（血清学）非密螺旋体抗体试验（nontreponemalantibodytests,NTrAT）:测抗类脂抗体（反应素regain）。

其靶抗原是宿主细胞被螺旋体感染后释放的类脂（lipoidal）物质、螺旋体释放的自身脂蛋白样物质（lipoprotein-likematerial）和心磷脂（cardiolipin）密螺旋体抗体试验（treponemalantibodytests,TrAT）：测抗Tp特异抗体。其靶抗原是Tp的Nichols株的纯化处理物。实验室诊断（NTrAT）NTrAT：1）VDRL（venerealdiseaseresearchlaboratory）2）RPR（rapidplasmareagin）3）USR（unheatedserumreagin）4）TRUST（toluidineredunheated-serumtest）NTrAT：抗原为心磷脂、胆固醇、卵磷脂按适当比例配制的乙醇溶液1）VDRL：待测血清加热灭活，显微镜观察。2）USR：血清不加热显微镜观察。3）RPR：抗原染成黑色，血清不加热，肉眼观察。4）TRUST：抗原染成红色，血清不加热，肉眼观察。实验室诊断（TrAT）★TPHA（T.pallidumhemagglutinationassay）★TPPA（T.pllidumparticleagglutinationassay）★金标记免疫层析★ELISA-TP★FTA-ABS（fluorescentTp-antibodyabsorption）★FTA-ABS-DS（FTA-ABSdoublestaining）★免疫印迹试验TrAT：抗原为梅毒螺旋体Nichols株特异抗原。（1）TPHA：Nichols株超声或SDS提取抗原，包被甲醛、鞣酸处理的SRBC,遇血清中抗体血凝。血清用Reiter株，牛、羊RBC，正常兔血清和兔睾丸提取物吸收。（2）TPPA：染成红色明胶颗粒包被抗原。试剂盒中未配吸收剂。（3）ELISA：纯化或重组T.pallidum抗原（15000、17000、42000、47000）包被，间接法或双抗原夹心法。未配吸收剂。

（4）FTA-ABS:Nichols株制片，丙酮固定，待测血清用含Reiter株吸收剂吸收。FITC-抗人IgG（IgM）示踪。（5）FTA-ABS-DS：同上，第一次荧光染色用四甲基异硫氰酸罗达明标记的抗人IgG；第二次荧光染色用FITC标记抗Tp抗体。（6）免疫印迹（WB）：Nichols株纯化抗原SDS，电转印至NC膜或PVDF膜，待测血清不吸收，与膜上抗原反应，再与酶标抗人IgG反应，显色。（7）金标记免疫层析：膜条上包被纯化的Tp抗原，待测血清不吸收，与膜端金标抗人IgG结合后层析至测试区与Tp抗原结合，出现呈色条带。梅毒血清学试验敏感性与特异性试验敏感性特异性一期二期潜伏三期VDRL78（74~87）10095（88~100）71（37~94）98（96~99）RPR86（77~100）10098（95~100）73（36~96）98（93~99）USR80（72~88）10095（88~100）─99TRUST85（77~86）10098（95~100）─99（98~99）NTrAT试验敏感性特异性一期二期潜伏三期FTA-ABS84（70~100）1001009697（94~100）FTA-ABS-DS80（69~90）100100─98（97~100）TPHA76（69~90）10097（97~100）9499（98~100）TPPA80（86~100）100100─96（95~100）ELISA-IgG………………97（97~100）…………99（98~100）注：无分期资料TrAT梅毒实验室检查难点本属包括4种对人致病和至少6种对人不致病的密螺旋体。Tp和其它该属螺旋体在形态学上无法区别；核酸杂交试验DNA同源性≧95%；已知的基因序列高度一致性；蛋白质结构及与某些单克隆抗体反应几乎相同。因此，只能依靠对人和实验动物的致病谱来加以区别。螺旋体的分类及致病性螺旋体种类

属种疾病传播方式或媒介Ⅰ疏螺旋体（Borrelia）伯氏疏螺旋体莱姆病硬蜱回归热螺旋体流行性回归热体虱赫姆疏螺旋体地方性回归热软婢奋森疏螺旋体多种口腔感染条件致病Ⅱ短螺旋体（Brachyspira）Ⅲ脊螺旋体（Cristispira）Ⅳ细丝体（Leptonema）Ⅴ钩端螺旋体（Leptospira）问号钩端螺旋体钩端螺旋体病接触疫水双曲钩端螺旋体Ⅵ小蛇形螺旋体（Serpulina）Ⅶ螺旋体（Spirochaeta）Ⅷ密螺旋体（Treponema）梅毒螺旋体梅毒性传播雅司螺旋体雅司病皮肤损伤品他螺旋体品他病皮肤损伤地方性螺旋体地方性梅毒粘膜损伤

梅毒螺旋体结构（1）长6~20μm,直径90~180nm，有6~14个规则螺旋，两端尖直。（2）外膜：有三层，含蛋白质、类脂、糖，有抗原性，对溶菌酶抵抗，对脂溶剂、SDS敏感。（3）胞质微丝：有外鞘及内核心，含大量蛋白质（4）菌体：圆柱形，包括细胞壁、胞质膜、胞质。（5）周质鞭毛：附着于菌体两端2~3条或4~6条。（6）基因组（Nichols株1.131×106bp，1998年）（7）抗原：特异性耐热多糖抗原（多糖--RNA），非特异性心磷脂、类脂抗原，特异性不耐热蛋白质，包括MW（15.5~190.0×103）的16种，其中15500、17000、42000、47000有特异性。血清学试验假阳性原因（一）其他的人类宿主相关螺旋体（1）口腔螺旋体（齿龈间隙牙菌斑）参与齿龈炎、牙周病。（2）皮肤相关螺旋体（外阴部皮脂腺分泌物）。（3）肠道螺旋体（结肠、直肠、粪便）参与腹泻等肠病。

血清学试验假阳性原因（二）

NTrATTrAT自身免疫病++疟疾+-免疫接种+-皮肤病