人类基因组学的研究进展

人类基因组学的研究进展

0我国基因功能研究的现状人类基因组的研究是21世纪生物学和医学发展的主流之一，它与人类疾病的预防和治疗密切相关。因此，基因组学在整个生命周期中发挥着非常重要的作用。近年来，对各组的控制取得了迅速发展。在许多一般生物实验模型中，已经检测到20多个细菌、革母菌、寄生虫、果苍蝇和其他生物的所有基因序列。2001年，完成了人类各组的所有序列图。中国生物科技工作者参与了1%的人类基因测序工作，并在2002年完成了水稻矩阵图的测定工作，在中国的遗传序列测量中取得了进展。然而，未来的基因功能研究是我们面前的一个重要研究方向。这就像本书。虽然你知道这本书中的每个词，但你不知道每句话中每句话的意思。只有了解基因功能的机制和应用价值才会变得重要。1非洲嘴唇浚人体生物模型尽管生物信息学(Bioinformatics)和基因芯片技术迅猛发展,加快了功能基因研究的进程.但它们只能根据一个已知功能基因序列推测另一个基因与其重迭的功能.由于基因片段尚有不同折迭等复杂的二级结构,其功能最终需要在有关生物模型中才能得到确定.有鉴于此,我们香港大学分子生物学研究所构建了以下生物模型进行功能基因组学的研究.①微生物模型:主要是细菌和酵母菌(BacteriaandYeast);②哺乳动物细胞模型(Mammaliancellculture);③转基因和基因敲除小鼠模型(Transgenicandknock-outmice);④非洲爪蟾模型(Xenopusleavis).细菌和酵母菌是现代医学研究不可缺少的工具,也是简单和较古老的功能基因研究平台.它的优点是培养方法简便,增殖周期快.缺点是单一细胞,不能阐明在组织和器官中的功能和作用.我们分子生物学研究所与香港大学巴斯德研究所合作建立了这一研究平台.组织细胞培养系统是研究基因功能,特别是研究高等动物基因功能的重要技术平台.常用的一些鼠类和人体细胞培养系统,用于研究基因表达,信号传导,细胞周期调控以及癌基因和抑癌基因的功能.但该系统也是单一细胞在体外的聚合体,不能提供整个生命体内更多的基因功能信息.而且,培养条件要求高,难于掌握和控制.我们运用多个细胞系进行癌基因和抑癌基因功能研究,信号传导及细胞周期调控的研究,同时也建立了细胞显微注射的技术平台.转基因及基因剔除小鼠模型:小鼠在生理上和人类极为接近.其基因组测序工作不久也将完成,转基因和基因剔除以修饰小鼠基因的技术对基因功能研究做出了杰出贡献.此外,小鼠的遗传资源十分丰富,且高分辨率的遗传及物理连锁图谱已建成,大量的变异可供用于研究人类的疾病.不足之处是,技术操作难度大,研究费用昂贵,实验周期较长,其胚胎在母体受内环境影响较大.我们建立并利用这一模型系统,开展了对糖尿病及神经系统疾病的研究.非洲爪蟾模型:以上三种模型系统,国内同行都比较熟悉,而非洲爪蟾研究基因功能还是近十年的事情,实际上非洲爪蟾作为发育生物学的研究模型已有数十年的历史.实验证明,高等动物的基因能够在低等动物中发挥并保持其生物作用特征.因此,人和鼠的功能基因都能在非洲爪蟾展现功能特征.我们于1999年建立了该模型系统,并对许多重要的基因如:BMP4,GATA1,GATA2,TBX3,PI3K,c-Jun,Makorin-2的功能进行了广泛而深入的研究.此外,还有其他我们尚未建立的生物模型.如线虫(C.elegan),果蝇(Drosophila)及斑马鱼(Zebrafish)等,他们都有各自特定的优点和缺陷,在动物基因的研究中发挥重要作用.2非洲党建带着于早期生物学发展的基因1999年,NIH经过多次反复论证及评选,确定非洲爪蟾为非哺乳动物类研究基因功能的最佳生物模型系统.2001年NIH研究课题基金申请指南明确规定用非洲爪蟾的近亲(Xenopus,tropicalis)研究基因功能及与人类健康和疾病相关的机制者给予最高优先(highestpriorities)资助.非洲爪蟾之所以获得研究者们如此青睐,是因为它有如下优点:①非洲爪蟾是两栖类脊椎动物,以进化学推论,它比其他非哺乳动物更接近哺乳动物,另外其胚胎发育周期较短,从受精卵到蝌蚪期只需3~4d,所以实验周期缩短,能较快获得实验结果;②蛙卵是由体外受精又在体外发育,所以发育期不会受到母体产生的多种因子的影响,实验结果只需考虑在各不同发育阶段所引起的表形变化;③在一只母蛙中,一次可获取数百受精卵和胚胎,实验材料较易取得,同时胚胎的不同发育期很容易识别.因此,很方便获得一定发育之胚胎作为实验材料及进行更深入的生物化学及分子生物学研究;④蛙卵较一般哺乳动物细胞大很多倍,所以,较容易在显微镜下进行显微操作,如显微注射,显微移植、显微切割等;⑤蛙胚胎作为一个生命个体比培养的细胞株能提供更多的生物信息.⑥mRNA在蛙卵中很容易转录成有活性的蛋白质,而目前制备mRNA较为简便;⑦许多重要基因在非洲爪蟾与哺乳动物间有同源性,因此也有相同的功能作用.如骨形成蛋白(BMP-4),这就为研究人类基因功能奠定了基础;⑧能有效利用数十年发育生物学研究的技术和成果,如蛙卵的分区、各细胞发育的既定命运等.但非洲爪蟾也有以下2个主要缺陷:①染色体为四倍体(tertraploid),也就是其基因组里有许多重复序列,不便于遗传学研究;②传代周期过长,从受精卵发育成具有生殖能力的成年蛙需要1~2a,这对建立新的动物种系是极为不利的.好在非洲爪蟾的近亲X.tropicalis虽然体型大小只有非洲爪蟾的一半,但它却正好弥补了上述两个缺陷.两者的比较见下表.新的研究报告也证明人类所有使用非洲爪蟾的研究技术,包括转基因、原位杂交、核苷酸探针等,都可较易地应用在X.tropicalis上.这些结果对于功能基因组学研究的学者,似乎找到了“十全十美”的生物模型的喜悦.再加上近年来建立的antisensemicrophlinooligonucleotide及RNAinterferene(RNAi)显微注射至非洲爪蟾的胚胎,可以忠实地“剔除”其目的基因.这些令人振奋的结果,也终于说服了美国国立卫生研究院(NIH)及其他研究机构着手制订X.tropicalis的基因组测序计划,预计2006年即可完成.因此,X.tropicalis在功能基因的研究中,既延续了非洲爪蟾(X.laevis)的原有优势,又弥补了它的不足.3主要研究方法3.1神经诱导活性)主要通过显微注射外源性有潜在功能的DNA,mRNA和protein(DNA和RNAbindingprotein;kinases及其他酶类),而有效地影响胚胎发育,在蝌蚪期出现相应的表型.如注射noggin,Xwnt8,Xvent1,Chordin以及siamois等,能使胚胎发育成双头、双脊髓轴,由此可判断这些基因有神经诱导作用;而BMP-4,mix-1,AP1,GATA1及GATA2能使胚胎发育成小头、大肚子、短尾巴;由此判断这些基因可能有腹侧化作用,从而抑制神经的发育.此方法需特别注意非生理性和人为的非特异性影响,如对胚胎的毒性作用等,而出现假的表型.此外,还需测定其对某一影响组织的分子标志物.3.2功能实现方法)该方法常用显性负性突变的蛋白(Dominant-negativeproteins)、显性负性突变的受体(Dominant-negativereceptor)、显性负性突变的配体(Dominant-negativeligands)、显性负性突变的转录因子(Dominant-negativetranscriptionfactor)、抗体(Antibodies)、反义核苷酸(Antisense),小分子干扰RNA(siRNA)等,得到与“功能获得”方法相反的实验结果.并且与其基因联合显微注射,可扭转“功能获得”方法引起的表型改变,从而进一步反证该基因的功能作用.该方法还能阻断基因信号传导,通过测定其他基因表达,确定该基因在其基因传导通路的位置及其上下游基因.例如,我们首次用去功能作用的BMP-4受体,注射到2细胞期的蛙卵胚胎内,在蝌蚪期,发现长出两个头和两个脊髓轴,从而反证BMP-4是一个神经发育抑制因子.用去功能Ras、Raf以及Jun转录因子,显微注射到蛙卵胚胎内,发育到一定时期,显微切割外殖体再培育至所需发育期,对外殖体行RT-PCR检测,从而确定了Ras、Raf、AP-1基因在BMP-4基因信号传导路中的位置.该方法也需要特别注意对胚胎的非特异性毒性反应.3.3错误表达基因自由基因检测非洲爪蟾的转基因技术是由英国剑桥EnriqueAmaya研究小组于1996年首次建立的一种新方法,该技术是对用非洲爪蟾进行基因功能研究的革命性的突破.它有如下优势:①能产生基因突变的种系;②能研究来自其他生物体(如斑马鱼,小鼠等)启动子(promotors)的基因调控;③能研究发育后期(如器官化期)的分子机制;④能用绿色荧光蛋白做标志物,在体内标记特异性的组织结构;⑤在胚胎发育过程中,能更好地时空控制(spatialandtemporalcontrol)错误表达基因(misexpressgene);⑥研究经费较转基因鼠少了很多,且在1d内可制造数以百万计的转基因蛙.由于新技术在非洲爪蟾中的不断应用,令人振奋的研究报告不断出现,以及它具有周期短、花费较少、实验条件易控制,以及操作技术建议等诸多优势,有学者预测在未来数十年乃至整个新世纪,以非洲爪蟾尤其是以X.tropicalis为生物模型研究功能基因将独领风骚.我国的基因测序工作已走在了国际先进行列,取得了很大的成绩,但在基因功能研究上和发达国家相比还有很大差距.基因测序工作有专门的仪器和程序化的流程,其科学原创性较小,与其说是科学研究,倒不如说是一个项目工程.而且世界上绝大多数科学工作者不赞成基因序列申请专利保护,基因工作者只需上网下载即可得到基因序列.而基因功