应激对即早基因表达的调节作用及其与crfmrna、hpa通路和行为的关系

应激对即早基因表达的调节作用及其与crfmrna、hpa通路和行为的关系

心理反应是指个体“意识到”环境对生理心理和社会功能系统的负荷，其反应可能是适应的或较差的。最近发现一对关系密切的原癌基因(proto-oncogens)c-fos/c-jun在中枢神经网路上,可由于心理应激等活动而立即、及时地进行转录,一过性地表达转译为Fos/Jun核蛋白,然后返回核内参与组成对其它靶基因转录调节的“转录因子”(transcriptivefactors)。这类原癌基因被称为“即刻早期基因”(IEG,immediateearlygenes)。但目前对即刻早期基因究竟在心理应激中扮演什么角色以及其与经典的应激通路下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)的关系尚不清楚。本研究通过制造社会失败(socialdefeat)应激动物模型,以研究应激对即刻早期基因c-fos表达的调节作用及其与CRFmRNA,HPA通路和行为之间的关系。材料和方法一、社会失败溶液内温度1.模型:雄性Sprague-Dawley大鼠(中国科学院上海实验动物中心),体重200-300g,社会应激模型基本按照Miscek的方法,雄性大鼠长期单独饲养。实验开始时,将实验组大鼠放入单独饲养大鼠笼中,单独饲养鼠会攻击实验鼠,撒咬侵入者的颈部与背部。在第一次攻击发生后实验持续8分钟,允许10分钟作为攻击潜伏期。社会失败(socialdefeat)的定义是:实验大鼠至少受到一次攻击,并且表现出驯服的姿势,如防御性直立,仰卧,静止不动等。2.行为测验:a.反映焦虑情绪的高架十字迷宫(plusmaze):高架十字迷宫包括两条开放臂(50×10cm)和两条闭合臂(50×10×40cm),由中央区(10×10cm)联结,室内为暗光(80lux)。实验过程伴白噪声。单盲,二位观察者分别观察每组50%的动物。大鼠从中央格面向闭合臂放入迷宫,记录5分钟内活动的情况,观察指标:(1)闭合臂进入次数(必须有两只前爪进入臂内);(2)开放臂进入次数;(3)闭合臂停留时间;(4)开放臂停留时间。b.反映探究活动及情绪反应的空场实验(openfieldmethod):木制箱100×100×50cm,地板用笔划成25方格20×20cm,沿墙格称外周格,其余为中央格。将动物放在正中央格,观察12分钟内活动情况。观察指标(1)方格间穿行次数:三爪以上跨入邻格的次数;(2)竖起或修饰次数:两前肢离地1cm以上的次数;(3)中央格停留时间。二、免疫组化和血清fli着色法(一)免疫组化:主要试剂:Ⅰ抗:兔多克隆fos抗体(由美国SantaCruzBiotech生产),fos抗体的特异性已被检验过,用过量的纯化fos蛋白与此抗体混匀后,用混合液做免疫染色,在阳性组织切片上结果为阴性。Ⅱ抗、Ⅲ抗:Dako公司ABC试剂盒。DAB(Sigma)。(二)方法:A灌注与取材:各组动物分别于应激后1小时,腹腔内注射戊巴比妥钠(60mg/kg)深度麻醉后,打开胸腔,经心主动脉插入导管,先用0.9%生理盐水灌洗(压力为100-120mmHg),再用新鲜配制的4%多聚甲醛(0.1M,PH值7.4)300ml,以先快后慢的原则灌注固定20分钟,取材后浸入30%蔗糖PBS(PH7.2)至脑组织下沉,AO切片机30μm连续冠状切片。B免疫组化反应步骤:脑片在PB中漂洗3次,然后在1.5%正常封闭血清中孵育20分钟抑制非特异性IgG,PB漂洗5×5min,含兔抗fos多克隆抗体(15000)4℃过夜,PB漂洗5×5min,生物素化二抗在1100的PB中室温下反应1hr,PB漂洗5×5min,ABC液110室温反应1hr,PB漂洗2×10min,用0.5%的TritonX-100/PBS洗30秒,在0.05%DAB,0.01%H2O2的TB中反应约10min显色,显微镜下控制,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树脂封片。C对照实验:用NGS和PB分别取代一抗和二抗做免疫组化,其余步骤同上。(三)原位杂交1.材料与试剂:DIG3′端标记试剂盒和DIG检测试剂盒均购自德国BoehringerMannheim公司,CRFmRNA寡核苷酸探针由美国Cybersyn公司合成,序列为:5′-CAGTTTCCTGTTGCTGTGAG-CTTGCTGAGCTAACTGCTCTGCCCTGGA-3′,经过GenBank同源序列检索。2.寡核苷酸3′端标记步骤以及原位杂交步骤参照德国BoehringerMannheim公司方法。(四)内分泌激素测定:1放射免疫分析方法(RIA)检测血浆ACTH:RIA试剂盒由DPC公司提供2.酶联免疫吸附方法(ELISA)检测血清Cortisol:Cortisol试剂盒(ELISA)由BIODATA公司提供。资料处理:用Olympus显微镜观察并照相,免疫组化结果通过计算机图像分析系统(MIAS300),分别测出各组FLI数密度。实验结果用SPSS8.0forwindows95统计软件分析,均用均数±标准差(X-±SD)表示。多个样本均数比较用单因素方差分析,两组间均数的比较采用独立样本t检验,显著性水平p<0.05。结果一、大鼠社会失败及应激后的开放臂次数分布(一)高架十字迷宫行为:应激组(n=12,7.4±4.6)与对照组(n=8,32.3±17.8)比较显著减少了大鼠在高架十字迷宫开放臂停留的时间(用开放臂时间占两种臂进入时间总和的百分比来表示,p<0.001)。应激组(n=12,17.8±9.5)与对照组(n=8,39.7±27.5)比较显著减少了大鼠进入高架十字迷宫开放臂的次数(用开放臂进入次数占两种臂进入次数总和的百分比来表示,p<0.05)。说明社会失败(socialdefeat)具有明显的产生应激后焦虑行为的作用。应激组(n=12,6.2±4.9)与对照组(n=8,7.1±4.6)大鼠总活动(overallactivity,开放臂进入次数与闭合臂进入次数之和)差异无显著性(p>0.05)。(二)空场实验:应激组(=12,23.5±12.7)与对照组(n=8,41.3±27.0)比较,显著减少了12分钟内大鼠方格间穿行次数(三爪以上跨入邻格的次数,p<0.05),应激组(n=12,25.5±16.4)与对照组(n=8,17.1±9.7)大鼠竖起修饰次数差异有显著性(两前肢离地1cm以上的次数,p<0.05)。中央格内停留时间,应激组(n=12,8.3±5.6)对照组(n=8,13.1±4.6)差异无显著性(p>0.05)。二、未应激空白对大鼠fos蛋白表达的影响光镜下观察,应激组FOS蛋白免疫反应物质呈蓝黑色颗粒状(硫酸镍铵加强法),位于神经细胞核内。以下丘脑室旁核(PVN)部位最为密集,未用硫酸镍铵加强则呈棕黄色。杏仁核、皮质部位均有较强的FOS蛋白表达,但弱于PVN。未应激空白对照组偶见零星的c-fos表达。抗体替换试验组未见阳性产物。用MIAS-300计算机图像分析系统在PVN和杏仁核部位随机取4-6个单位面积(134.553um2)计算FOS蛋白免疫反应物质的数密度,统计学分析,应激组与空白对照组比较,应激组下丘脑室旁核(54.0±9.4)与杏仁核(14.9±4.6)部位的FOS蛋白免疫反应物质与空白对照组下丘脑室旁核(4.2±1.8)与杏仁核(2.7±1.1)的数密度差异有显著性(p<0.001)。三、光镜下蓝黑色颗粒的聚集应激诱导的mRNACRF主要分布在下丘脑室旁核部位,以及杏仁核的部分区域,光镜下可见大量蓝黑色颗粒聚集在细胞核周围的胞浆内。空白对照组下丘脑室旁核部位未检测到mRNACRF表达。四、组大鼠术后总参数比较社会应激使大鼠血清皮质醇浓度(119.2±33.4u/ml)明显地增高,与对照组大鼠(56.5±10.1)比较差异有显著性(p<0.05)。而社会应激后大鼠血浆ACTH浓度(85.7±27.1pmol/l)高于对照组(27.1±9.2),但差异无显著性。讨论一、抗焦焦虑药物的疗效评估大多数应激与焦虑的生化基础研究,其资料均来自动物模型及抗焦虑药物作用的实验,因此寻找更为可靠而有效的反映心理应激焦虑反应的动物模型成为了研究的关键。但是过去广泛使用的模型存在着两个明显的缺陷:首先,采用的都是一些生理性的,非自然状态的应激源,如电击、寒冷、食物及水的剥夺等。显然,这些措施往往会改变动物的生理状况因而影响其行为反应,忽视了心理社会因素的存在。另一个问题就是缺乏一种准确的指标来客观地反映焦虑,拿抗焦虑药物作用实验来说,我们观察到的行为到底能不能代表焦虑,究竟是药物的镇静作用还是抗焦虑作用?本研究采用的动物模型参考了Montgomery和Miczek的方法,既考虑到了诱导焦虑的应激源的社会心理因素,也为从生理、行为、药物方面评估焦虑提供了客观的工具。我们发现,把实验大鼠放入经长期孤独饲养而具有攻击性的大鼠笼中。具有攻击性的大鼠本能的对侵入者发起攻击从而保卫自己的领地。实验大鼠出现“战斗或逃跑(fightorflight)”的应激反应,表现出一系列防御性姿势和逃跑行为以及长期的生理和行为适应反应,如外周血ACTH和Cortisol浓度增高,c-fos在大脑的广泛区域表达。实验大鼠受到了持续的威胁,但由于受到保护而不产生严重的躯体伤害,这就突出了应激源的“社会心理”因素。评估抗焦虑药物疗效的工具是根据Montgomery的思想设计的,他发现当大鼠暴露于由两条开放臂和两条闭合臂组成的高架十字迷宫时,大鼠进入闭合臂的次数与时间均明显多于开放臂。Montgomery认为在面对新奇刺激时,大鼠同时产生探究的冲动与恐惧,这就造成了探究——回避的冲突行为,从而产生焦虑。而抗焦虑药物能明显增加进入开放臂的次数与时间。反映探究活动及情绪反应的空场实验(openfieldmethod)则可以排除动物服药产生的镇静作用的影响。我们的观察也证明社会应激使大鼠更加偏好高架十字迷宫的闭合臂,大鼠在闭合臂里停留的时间与进入的次数都远远多于开放臂。这些结果支持Montgomery的理论,即这种偏好反映了大鼠由于焦虑或害怕而厌恶开放臂。根据我们的实验观察,动物在开放臂内表现出更多的焦虑相关行为,如僵住不动,排便等。因此我们认为本研究中所采用的社会应激性焦虑模型是建立在大鼠自发行为的基础上,可以排除伤害性应激源如电击、食物及水的剥夺等因素的影响,可以用来深入研究应激的分子机制。二、crf与c-fos近年来,用心理应激源作为刺激,以即刻早期基因c-fos的表达作为脑功能性示踪的“标志”,对心理应激的脑机制进行了较深入的研究,取得了相当的进展。焦虑作为一种情绪反应,包括本能和所伴随的植物神经反应与边缘系统的活动有密切的关系。本研究通过图像分析系统对于下丘脑室旁核以及杏仁核部位fos免疫反应阳性神经元(FLI)的研究证明,下丘脑部位,其次是杏仁核的在焦虑机制中起重要作用。目前认为c-fos的第三信使假说认为在神经系统对内源及外源信号的应答过程中,第一级神经元的兴奋引起神经递质(或激素)的分泌,作为第一信使,作用于靶细胞的细胞膜,再由跨膜转导机制将信号传入细胞内,激活了胞内的第二信使,引起靶细胞特定的反应,在引起细胞瞬时反应的同时,也可以激活即刻早期基因(如c-fos、c-jun)的转录,该转录生成的mRNA逸出胞核到胞浆翻译成fos、jun等磷蛋白,重新进入核内,组成不同的二聚体,作用于靶基因上的AP-1结合位点(TGACTCA)等,调节靶基因的表达,正是这些快速生成的核蛋白把第一和第二信使传来的信息与靶基因表型的改变偶联起来,因此被称为核内第三信使。即刻早期基因产物一转录因子可能作为信号传递通路的第三信使调节靶基因的表达,导致细胞表型的改变,从而调控细胞乃至神经系统的生理反应。但是,到目前为止,支持这一假说的证据主要都来自于阿片肽基因,包括前脑腓肽(PENK)及前强腓肽(PDYN)基因的研究。CRF被广泛认为是一种主要的内源性焦虑信号,主要作用于下丘脑室旁核。下丘脑为间脑前臂,可以接受末端信息,又能调节植物神经系统和神经内分泌功能,本研究运用免疫组化和原位杂交技术进行的研究表明,社会心理应激引起的c-fos表达主要分布在下丘脑室旁核,杏仁核,与CRFmRNA表达部位重叠。Coplan-JD报道CRF拮抗剂,α-螺旋CRF9-41能显著减少下丘脑PVN及蓝斑(LC)神经元c-fos表达。而且中枢注射CRF诱导mRNACRF快速表达分布的区域与应激引起的c