食品安全检测方法的研究进展

食品安全检测方法的研究进展

自中国食品检验方法（gb4799-84）颁布以来，中国的食品微生物检验逐渐走上了标准化的发展道路。随着微生物检验方法的逐步形成和完善，为了保证中国微生物检验的质量，许多微生物检验工作者进行了不断的探索和积累，并逐步形成了一些有效的方法。2000年中国疾病预防控制中心(CDC)建立了全国食品污染物监测体系,构建了国家级监控网络和数据库,将微生物危险性评估技术、DNA指纹图谱分型技术、病原微生物PCR快速检测技术作为食品安全关键技术进行攻关研究,运用到我国的食源性疾病监控体系上,该监测网的建立使我国疾病预防控制部门及时掌握食源性疾病的状况,快速应对重大食源性疾病突发事件,为食源性疾病监控提供了一个技术平台,为缩小我国食源性疾病监控技术与发达国家的差距奠定了坚实的基础。目前我国食品卫生微生物检验方法种类繁杂,既有国家标准检验方法,又有大量行业方法和企业方法。本文就国内外的食品微生物检测技术应用和研究状况综述如下。1微生物检验方法落后，不能应对快速高效检验方法的要求2003年颁布的《食品卫生检验方法微生物学部分GB4789-2003》更新和完善了各类微生物的生化检测标准，但传统的食品卫生微生物检验方法须经过增殖培养、分离纯化、生化试验、血清学试验等，检验步骤繁琐、耗时长，不能应对市场需求快速准确检验方法的要求。为了解决上述矛盾，产生许多改进的新方法，如目前已经生产出了多种微型化的生化试剂盒、鉴别培养基、快速测试片等产品可供实际应用。1.1实验改进的效果生化试剂盒(生化鉴定管)的原理就是将多种常用的细菌生化分析试剂、培养基集成在特定的微型化的装置中，将传统方法中需要多次完成的实验改进为一次完成，能够在短时间内获得结果，从而节约了样品的分析时间，节约成本，提高了检验速度。1.2微生物培养基鉴别培养基是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助快速鉴别某种微生物的一种培养基。例如对大肠杆菌O157:H7进行检测的SMAC琼脂培养基等，其主要原理是细菌产生特定的代谢产物同培养基中生化物质进行反应，从而根据不同的颜色进行判断。1.3检品的质量指标测定快速测试片法是指以纸片、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在载体上面，通过微生物在其上的生长、显色来测定食品中微生物的方法。其具有以下优点：可测定少量检品、操作简便、易消毒保存、价格低廉、污染小、能真实反应检品中的细菌数等。近年来这种集化学、高分子学和微生物学于一体的检测方法开始发展起来，以滤纸和已经通过AOAC(国际分析化学协会)认可的美国3M公司的Petrifilm为载体的测试片已开始被广泛应用，目前已商品化的微生物测试片有：菌落总数测试片、大肠菌群测试片、霉菌和酵母菌测试片、沙门氏菌测试片和金黄色葡萄球菌测试片。1.4vitek-ams检测微生物的自动化检测具有操作标准化、简便、快捷、准确率高等特点，是微生物检测发展的方向之一。国内外现在已有很多全自动微生物分析系统问世，如Vitek系统、Biolog系统、Midd系统、Sensititre系统、Autosceptor系统、BAX系统和Phoenix细菌鉴定/药敏试验系统等，其中法国生物梅里埃的Vitek-Ams系统已被AOAC列为法定分析法。Vitek系统的原理是将菌悬液接种到在含有干燥的生化试剂或培养基的聚苯乙烯卡片内进行反应，然后将卡片放入具有读数功能的孵箱内，每隔一定时间，仪器会自动检测培养基的发酵情况，并换算成能被计算机所接受的信息，最后由计算机比对数据库得出鉴定结果。2新技术的建立早在1896年，Widal就利用伤寒病人血清与伤寒杆菌发生特异性凝集的现象成功地诊断伤寒病。后来根据凝集反应的原理，以后又发展了各种间接凝集试验、间接凝集抑制试验以及固相免疫吸附血凝试验、各类标记技术(如荧光、放射、胶体金等)等新方法，逐步建立了免疫血清法、乳胶凝集法、免疫扩散法、免疫磁珠法、免疫沉淀法、抗体印迹法、ELISA(酶联免疫吸附)法和免疫胶体金技术等微生物免疫学检测技术。免疫学方法具有快速、灵敏度高、特异性好等优点，近年来以ELISA法、免疫胶体金技术、酶联荧光免疫分析技术(VIDAS)发展最为迅速，下面简单介绍下这两种方法。2.1抗体检测方法ELISA法是一种固相免疫测定技术，其先将抗体或抗原包被到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。检测时将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应，再加入酶标抗体与免疫复合物结合，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离的未结合成分，最后加入酶反应底物，根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度值的大小进行定性或定量分析。根据检测目的和操作步骤不同，有双抗体夹心法、间接法、竞争法三种类型的常用方法。白封闭剂遮蔽,使检测灵敏度受影响。Ngai等先将金黄色葡萄球菌蛋白A(ProteinA)固相化，然后利用ProteinA能和IgG的Fc段稳定结合的特点，使IgG抗体有序性地结合到固相上，大大增加抗体对抗原的有效结合位点，导致检测灵敏度大幅提高。2.2胶体金标记的作用免疫胶体金技术(immunogoldlabellingtechnique)是指氯金酸(HAuCI4)在还原剂存在下，被还原析出纳米级的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。蛋白质等被吸附到胶体金颗粒表面形成包被而被胶体金标记，于显微镜下可见黑褐色颗粒。当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而可用于定性或半定量的快速免疫检测。目前在微生物学检验中常用的是快速免疫金渗透法和免疫层析法。2.3荧光免疫分析法2002年，美国开始生产自动酶联荧光免疫检测系统(VIDAS)。酶联荧光免疫分析技术将酶系统与荧光免疫分析结合起来，在普通酶免疫分析的基础上用理想的荧光底物代替生色底物,就可提高分析的灵敏度和增宽测量范围，减少试剂的用量。酶放大技术、固相分离及荧光检测三者的联合成为荧光免疫分析中最灵敏的方法，已用于检测李斯特菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7等。3代谢研究技术代谢学技术是指利用微生物代谢的理论，通过比对微生物生理生长的一些如底物、电阻抗、代谢产物的变化特性，而达到微生物检测目的的方法。3.1其他反应物用量ATP普遍存在于包括微生物在内的一切活细胞内，其做为荧光素酶直接作用底物。在生物发光反应中，当其他反应物过量时，发出的总光量和最大光强度同ATP的量成正比。ATP生物发光技术的原理是荧光素酶(fireflyluciferase)以D-荧光素(D-luciferin)、三磷酸腺苷(ATP)和O2为底物，在Mg2+存在时，将化学能转化为光能，发出光量子，反应可表示如下：3.2培养基电阻变化电阻抗技术是指微生物在生长繁殖的过程中，会使底物大分子电惰性物质如碳水化合物、蛋白质和脂类等，代谢降解为具有电活性的小分子物质，如乳酸盐、醋酸盐等，使培养基的电阻发生变化，通过检测培养基的电阻变化情况，即可判定微生物在培养基中的生长繁殖情况。陈广全等已用该法检测食品中沙门氏菌。3.3生物的检出和鉴别微热量计技术是通过测定微生物生长时产生的热量变化进行微生物的检出和鉴别。用微量热计测量微生物在生长过程中产热量等数据经计算机分析，并在绘制成以产热量和时间组成的热曲线图，并和已知微生物热曲线图直观比较，对微生物做出鉴别。3.4放射性14c标记放射测量技术是根据微生物在生长繁殖过程中代谢碳水化合物产生CO2的原理，把微量的放射性14C标记引入碳水化合物或盐类等底物分子中进行检测的。在微生物生长时，这些底物被利用并释放出含放射性的CO2，然后通过14C自动化放射测定仪Bactec测量CO2的含量，从而根据碳14CO2含量的多少来判断微生物的数量。4检测方法学上的应用生物传感器的工作原理是，待测物质进入固定的生物功能敏感元件(由酶、抗原、抗体、细胞器、完整细胞、激素、核酸等制成)后，经分子识别而发生生物学反应，产生的信息如光、热等被相应的信号转换器变为可定量和可处理的电信号，从而换算出被测物质的量或浓度。目前已经商品化的传感器有酶传感器、免疫传感器、微生物传感器、DNA杂交传感器、细胞器传感器、仿生传感器、分子印迹传感器等。生物传感器的出现掀起了微生物检测方法学上的一场革命，可以也使食品工业生产和包装过程中微生物自动检测成为可能。He等提出了一项新的生物纳米技术，该技术是采用生物修饰的纳米颗粒(纳米颗粒起到极强的信号放大作用)，通过荧光信号为基础的免疫试验，快速、准确地检测出单个细菌。4.1光催化机械工作原理光纤传感器由光学系统、电子学系统、数据采集系统及控制与处理系统组成。目前使用的光纤材料是聚苯乙烯。光纤传感器中激光激发光路产生的光波在光纤全反射的过程中激发光纤纤芯表面标记在生物分子(蛋白、核酸等)上的荧光染料，接受光路接受荧光信号，并由光电倍增管转换成电信号，计算机对输出的电信号进行分析并给出光电倍增作电压的控制电压值、光信号值、功率值及光信号/功率值。Anderson等应用光纤传感器RAPTOR，光后检测鼠疫杆菌F1抗原、葡萄球菌肠海素、蓖麻海素、炭拍芽他、土拉弗氏菌等。魏华等用光纤生物传感器FOB-3检测炭疽杆菌、鼠疫杆菌及葡萄球菌肠毒素B。4.2spr检测原理表面等离子共振(SPR)传感器根据不同待测生物分子的特点，将已知生物分子(蛋白、核酸等)借助共价键或非特异性吸附等作用固化在几十纳米厚的金属膜表面，然后加入能够与之结合的目标生物分子，由此引发的光学信号随即被SPR传感器转化成电信号进行检测并分析，SPR检测方法能够实时对生物分子或无机分子之间的相互作用模式及动力学进行检测。Meeusen等应用SPR生物传感器对食品中的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)及大肠杆菌(Escherichiacoli)O157:H7进行检测。5流式细胞仪检测流式细胞技术流式细胞术(flowcytometer,FCM)是采用流式细胞仪对单个细胞或其他生物微粒进行快速定性、定量分析与分选的一门技术。FCM可通过荧光染料标记可检测病原菌、毒素和血清抗体，还可在细胞悬液中原位杂交产生荧光检出被病毒感染细胞内的特异性病毒核酸(DNA或RNA)。流式细胞仪主要由细胞流动室(包括样品管、鞘液管)、激光聚焦区、检测系统、数据处理系统等4部分组成，其工作原理是将被检测对象制备成一定浓度的细胞(微粒)悬液，经荧光染色后放入流式细胞仪的样品管中，细胞在气体的压力下进入鞘液管，在鞘液的约束下，细胞(微粒)排列成单列从流动室的喷嘴高速喷出成为细胞(微粒)液粒，经荧光染色后的细胞经过激光聚焦区时受激光激发，产生散射光和荧光信号，通过一些波长选择通透性滤光片，可以将不同波长的散射光和荧光信号区分而将单个细胞(微粒)液滴分离，并由计算机进行图象及数据处理。现在该技术已经能够检测纯化的DNA可达pg级水平，在10min内可以完成数据的收集和分析。Cohen等用荧光染料EB和光散射信号在2h内分别在43个不同来源的临床标本中检测出细菌。Tapp等使用类似方法对苏云金杆菌产生的毒素进行检验和示踪，结果显示FCM比斑点ELISA法更敏感、快速。6其他微生物检测PCR是在体外合适条件下，以DNA(或RNA)为模板，以一对人工合成的寡核苷酸为引物在热稳定DNA聚合酶作用下特异性扩增DNA片段的技术。整个反应过程通常由20～40个PCR循环组成，每个PCR循环包括高温变性—低温复性—适温延伸三个步骤。自1985年美国PE-Cetus公司Mullis等人发明PCR技术以来，经发展并结合其他技术衍出了许多PCR优良技术，如反转录PCR、多重PCR、不对称PCR、错配PCR、PCR-RFLP、PCR-SSCP、PCR-ASO、RAPD-PCR、DDRT-PCR、定量PCR、免疫PCR等。PCR法检测食品中的微生物首先要富集细菌细胞，通常经离心沉淀、滤膜过滤等方法可从样品中获得微生物细胞，然后裂解细胞,使细胞中的DNA释放，再根据微生物所特有的特异性序列来设计引物，扩增细胞靶特异性的DNA序列，最后用电泳法或特异性核酸探针检测扩增的用细菌中特异性的DNA序列。PCR技术只需数小时，就可以电泳法检测出0.01mgDNA中仅含数个拷贝的模板序列，特异性极高。近年来用PCR技术检测食品中的致病菌的方法有多种，如常规PCR、套式PCR、荧光定量PCR、多重PCR等，也可几种方法结合运用。保守16～23SrRNA区域几乎存在于所有细菌中，这也为细菌的检测提供了理论依据，可通过反转录PCR扩增此16～23SrRNA区间序列鉴别出非常接近的菌种和种内细菌。Rahn等以沙门氏菌侵袭因子invA基因为目的基因，用PCR法对沙门氏伤寒进行检测。LukeT.Daum等利用Real-TimePCR法3h内可从鸡肉中检出沙门氏菌。Tsen等通过选择大肠杆菌的16SrRNA片段进行PCR扩增来检测水中的大肠杆菌细胞，可以达到1E.coilcell/100ml的检测限。卢林耿等用PCR法检测大肠杆菌O157:H7的产志贺样毒素基因，实验表明引物具有高特异性。杨小鹃等利用多重PCR对副溶血弧菌进行了检测。7dna探针检测方法基因探针微生物检测技术是在SouthernBlotting等生物技术基础上结合了PCR技术发展起来的，其原理是从微生物中提取或扩增特异性的DNA片段，纯化后再将此DNA片段标记上可被检测的指示剂，如放射性同位素、荧光物质等，使之成为特异性的DNA探针。微生物经过处理后固定于另一固相表面上，经洗涤变性后加入DNA探针进行杂交，DNA探针可以与同源性的靶DNA进行互补性结合，依据指示剂选用合适的方法进行检测。Chiton公司于1994年推出了检测微生物的分支探针试剂盒。KerdahiKF等曾进行了无放射性的探针进行检测单核细胞增生李氏菌，认为敏感性和特异性都很好。8生物材料的犯罪表现形式生物芯片是通过缩微技术，根据分子间特异性地相互作用的原理，将生物分子(寡聚核苷酸、cDNA、基因组、DNA、多肽、抗原、抗体等)固定于硅片、玻璃片、塑料片、凝胶、尼龙膜等固相介质上形成的生物分子点阵。在待分析样品中的生物分子与生物芯片的探针分子发生杂交或相互作用后，利用激光共聚焦显微扫描仪等对杂交信号进行检测和分析，实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。按照芯片上固化的生物材料的不同，可以将生物芯片划分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片。按照生物芯片的制作技术，可以将生物芯片划分为微矩阵和原位合成芯片。8.1dna芯片分类现有的PCR扩增法1次只能对1种基因成分进行检测,对有多种细菌污染的食品则无从下手，基因芯片具有高通量能并行检测的优点，仅靠一个实验就能检测出大量的未知菌，所以基因芯片技术在微生物研究领域的成功经验为其应用于食品微生物特别是致病菌的检测打下了基础。根据芯片上探针分子种类的不同，基因芯片可以分为寡核苷酸芯片、cDNA芯片与DNA芯片。按照基因芯片的用途可分为表达谱芯片、诊断芯片、指纹图谱芯片、测序芯片、毒理芯片等等。1992年，Affymatrix公司Fodor领导的小组运用半导体照相平板技术，对原位合成制备的DNA芯片作了首次报道，这是世界上第一块基因芯片。1995年，Stanford大学的BrownP实验室发明了第一块以玻璃为载体的基因微矩阵芯片，标志着基因芯片技术进入了广泛研究和应用的时期。基因芯片研究在国内也有了很快的发展，如复旦大学、中科院上海冶金所、清华大学、联合基因有限公司、军事医学科学院、中科院上海细胞所等单位已在生物芯片技术方面取得了较大突破。Appelbaum设计了一种鉴别诊断芯片，将高度保守基因序列和血清型所特有的标志基因固着于芯片表面，同时含有细菌所共有的16SrDNA保守序列以确定为细菌污染标志，对几种细菌进行鉴别。李君文等建立了以基因芯片技术为基础的水中常见致病菌的快速检测与鉴定技术获得了较高的敏感性。8.2激光扫描检测蛋白质芯片是对固相载体