酶的非水相催化课件

第六章酶的非水相催化第六章酶的非水相催化1本章内容提要：■酶非水相催化的研究概况■有机介质中水和有机溶剂对酶催化反应的影响■酶在有机介质中的催化特性■有机介质中酶催化反应的条件及其控制■有机介质中酶催化的应用本章内容提要：■酶非水相催化的研究概况2误区：只有在水溶液中酶才具有催化活性在非水相中，酶分子受到非水介质的影响，其催化特性与在水相中催化有着较大的不同。酶在非水介质中进行的催化作用称为酶的非水相催化。第一节酶非水相催化的研究概况误区：只有在水溶液中酶才具有催化活性3酶的非水相催化主要包括以下几种：◆有机介质中的酶催化◆气相介质中的酶催化◆超临界流体介质中的酶催化◆离子液介质中的酶催化适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。酶在超临界流体中进行的催化反应。是指酶在离子液中进行的催化作用。酶的非水相催化主要包括以下几种：◆有机介质中的酶催化适用于底4是指温度和压力超过某物质超临界点的流体。超临界流体

超临界流体萃取仪是指温度和压力超过某物质超临界点的流体5在酶的非水相催化中，研究最多的非水介质是有机溶剂。1984年，克利巴诺夫（Klibanov）等人在有机介质中进行了酶催化反应的研究。结果表明，只要条件适合，酶可以在有机介质中催化疏水性底物进行反应转化为产物。使酶在非水介质中的催化作用研究取得了突破性的进展。在酶的非水相催化中，研究最多的非水介质是有机溶剂。6此后，人们对有机介质中酶的催化作用进行了许多研究许多酶都可以在适当的有机介质中起催化作用。而且酶在有机介质中的热稳定性比水溶液中显著提高。近20多年来，酶在非水介质，特别是有机介质中的催化反应受到重视，发展很快。此后，人们对有机介质中酶的催化作用进行了许多研究7第二节有机介质中水和有机溶剂

对酶催化反应的影响一、有机介质反应体系■微水介质体系微水主要是酶分子的结合水，它对维持酶分子的空间构象和催化活性至关重要。另外一部分水分配在有机溶剂中。由于酶分子不能溶解于疏水有机溶剂，所以酶以冻干粉或固定化酶的形式悬浮于有机介质中，在悬浮状态下进行催化反应。

通常所说的有机介质反应体系主要是指微水介质体系。第二节有机介质中水和有机溶剂

对酶催化反应的影响一、有机8■与水溶性有机溶剂组成的均一体系酶和底物都是以溶解状态存在于均一体系中。由于极性大的有机溶剂对一般酶的催化活性影响较大，所以能在该反应体系中进行催化反应的酶较少。

然而该体系近几年来却受到极大的关注。这是因为辣根过氧化物酶（HRP）可以在均一体系中催化酚类或芳香胺类底物聚合生成聚酚或聚胺类物质。■与水溶性有机溶剂组成的均一体系酶和9■与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系游离酶、亲水性底物或产物溶解于水相，疏水性底物或产物溶解于有机溶剂相。如果采用固定化酶，则以悬浮形式存在两相的界面。催化反应通常在两相的界面进行。一般适用于底物和产物两者或其中一种是属于疏水化合物的催化反应。应用不广泛，研究较少。■与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系10■正胶束体系肥皂中的高级脂肪酸钠和合成洗涤剂中的活性物质分子都有长链的疏水基（亲油基）和短小的亲水基。当它们溶于水时，排列在水表面的分子，亲水基埋入水下，疏水基越出水面。这种排列使水表面的水分子减少，水的表面张力降低。能降低表面张力的物质，叫做表面活性剂。溶在水里的表面活性剂，会聚集成几十个分子的胶束（亲水基朝外、疏水基朝内的圆柱状或圆球状物质）。在大量水溶液中含有少量与水不相混溶的有机溶剂加入表面活性剂后形成的水包油的微小液滴。■正胶束体系肥皂中的高级脂肪酸钠和合成洗涤剂中的活性11酶在胶束外面的水溶液中，疏水性的底物或产物在胶束内部。反应在胶束的两相界面中进行。去污过程首先是织物纤维和污垢被洗涤剂润湿、渗透，织物和污粒上定向吸附着活性物的单分子层。经过机械搅拌或搓洗，污粒脱离到水中，产生乳化、分散、悬浮等现象。还有一部分污垢（油脂、钙皂、色料）被增溶到活性物的胶束中，被水洗去。酶在胶束外面的水溶液中，疏水性的底物12■反胶束体系

■反胶束体系

13二、水对有机介质中酶催化的影响酶都溶于水，只有在一定量的水存在的条件下，酶分子才能进行催化反应。

所以酶在有机介质中进行催化反应时，水是不可缺少的成分之一。有机介质中水的含量多少对酶的空间结构、催化活性、稳定性、催化反应速度等都有密切关系，水还与酶催化作用的底物和反应产物的溶解度有关。二、水对有机介质中酶催化的影响酶都溶14◆水对酶分子空间构象的影响酶分子需要一层水化层，以维持其完整的空间构象。维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量称为必需水。必需水与酶分子的结构和性质有密切关系。不同的酶，所要求的必需水的量差别很大。因为必需水是维持酶分子结构中氢键、盐键等副键所必需的，而氢键和盐键又是酶空间结构的主要稳定因素，故酶分子一旦失去必需水，就必将破坏其空间构象失去催化功能。◆水对酶分子空间构象的影响酶分子需15例如，每分子凝乳蛋白酶只需50分子的水，就可以维持其空间构象而进行正常的催化反应；而每分子多酚氧化酶却需3.5×102个水分子，才能显示其催化活性。例如，每分子凝乳蛋白酶只需50分子的16◆水对酶催化反应速度的影响在催化反应速度达到最大时的水含量称为最适水含量。◆水活度在有机介质中含有的水，主要有两类，一类是与酶分子紧密结合的结合水，另一类是溶解在有机溶剂中的游离水。研究表明，在有机介质体系中，酶的催化活性随着结合水量的增加而提高。在结合水量不变的条件下，体系中水含量的变化对酶的催化活性影响不大。◆水对酶催化反应速度的影响在催化反应速17因此可以认为，在有机介质体系中，结合水是影响酶催化活性的关键因素。而水含量却受到酶分子以外的各种因素的影响。因此可以认为，在有机介质体系中，结合水18三、有机溶剂对有机介质中酶催化的影响有机溶剂是有机介质反应体系中的主要成分之一。常用的有机溶剂有辛烷、正己烷、苯、吡啶、季丁醇、丙醇、乙腈、二氯甲烷。三、有机溶剂对有机介质中酶催化的影响有19■有机溶剂对酶结构与功能的影响有些酶在有机溶剂的作用下，其空间结构会受到某些破坏，从而使酶的催化活性受到影响甚至引起酶的变性失活。例如，碱性磷酸酶冻干粉悬浮于乙腈中20h,60%以上的酶不可逆地变性失活；悬浮在丙酮中36h，75%以上的酶呈现不可逆的失活等。在酶的冷冻干燥的过程中，应当加进蔗糖、甘露醇等冷冻干燥保护剂，以减少酶的变性失活。■有机溶剂对酶结构与功能的影响有些20■有机溶剂对酶活性的影响有些有机溶剂，特别是极性较强的有机溶剂，如甲醇、乙醇等，会夺取酶分子的结合水，影响酶分子微环境的水化层，从而降低酶的催化活性，甚至引起酶的变性失活。有机溶剂的极性越强，越容易夺取酶分子结合水，对酶活力的影响就越大。例如，正己烷能够夺取酶分子0.5%的结合水，甲醇可以夺取酶分子结合水的60%。■有机溶剂对酶活性的影响有些有机溶剂，21■有机溶剂对底物和产物分配的影响有机溶剂与水之间的极性不同，在反应过程中会影响底物和产物的分配，从而影响酶的催化反应。酶在有机介质中进行催化反应，酶的作用底物首先必须进入必需水层，然后才能进入酶的活性中心进行催化反应。反应后生成的产物也首先分布在必需水层中，然后才从必需水层转移到有机溶剂中。产物必须移出水层，酶催化反应才能继续进行下去。■有机溶剂对底物和产物分配的影响有机22有机溶剂能改变酶分子必须水层中底物和产物的浓度。如果有机溶剂的极性很小，疏水性太强，则疏水性底物虽然在有机溶剂中溶解度大，浓度高，但难于从有机溶剂中进入必需水层，与酶分子活性中心结合的底物浓度较低，而降低酶的催化速度；如果有机溶剂的极性过大，亲水性太强，则疏水性底物在有机溶剂中的溶解度低，底物浓度降低，也使催化速度减慢。所以应该选择极性适中的有机溶剂作为介质使用。有机溶剂能改变酶分子必须水层中底物和23第三节酶在有机介质中的催化特性■底物专一性在有机介质中，由于酶分子活性中心的结合部位与底物之间的结合状态发生某些变化，致使酶的底物特异性会发生改变。第三节酶在有机介质中的催化特性■底物专一性24试解释现象胰蛋白酶等蛋白酶在催化N-乙酰-L-丝氨酸乙酯和N-乙酰-L-苯丙氨酸乙酯的水解反应时，酶在水溶液中催化苯丙氨酸乙酯水解的速度，比在同等条件下催化丝氨酸乙酯水解的速度高104倍；而在辛烷介质中，催化丝氨酸乙酯水解的速度却比催化苯丙氨酸乙酯水解的速度快20倍。

请解释上述现象。（8分）试解释现象胰蛋白酶等蛋白酶在催化N-25这是因为在水溶液中，底物与酶分子活性中心的结合主要依靠疏水作用，疏水性较强的底物，容易与活性中心部位结合，催化反应的速度较高，而苯丙氨酸的疏水性比丝氨酸强，所以速度快。（5分）而在有机介质中有机溶剂与底物之间的疏水作用比底物与酶之间的疏水作用更强。结果疏水性较强的底物容易受有机溶剂的作用，反而影响其与酶分子活性中心的结合。（3分）这是因为在水溶液中，底物与酶分子活性26不同的有机溶剂具有不同的极性，所以在不同的有机介质中，酶的底物专一性也不一样。一般说来，在极性较强的有机溶剂中，疏水性较强的底物容易反应；而在极性较弱的有机溶剂中，疏水性较弱的底物容易反应。例如，枯草杆菌蛋白酶催化N-乙酰-L-丝氨酸乙酯和N-乙酰-L-苯丙氨酸乙酯与丙醇的转酯反应，在极性较弱的二氯甲烷或者在苯介质中，含丝氨酸的底物优先反应；而在极性较强的吡啶或季丁醇介质中，则含苯丙氨酸的底物首先发生转酯反应。不同的有机溶剂具有不同的极性，所以在不同的有机介质中，酶的底27■对映体选择性酶的对映体选择性是酶在对称的外消旋化合物中识别一种异构体的能力大小指标。酶在水溶液中催化的立体选择性较强，而在疏水性强的有机介质中，酶的立体选择性较差。例如，蛋白酶在水溶液中只对含有L-氨基酸的蛋白质起作用，水解生成L-氨基酸。而在有机介质中，某些蛋白酶可以用D-氨基酸为底物合成由D-氨基酸组成的多肽等。这一点在手性药物的制造中，有重要应用。■对映体选择性酶的对映体选择性是酶在28■区域选择性酶在有机介质中进行催化时，具有区域选择性，即酶能够选择底物分子中某一区域的基团优先进行反应。区域选择系数■区域选择性酶在有机介质中进行催化时29■键选择性键选择性与酶的来源和有机介质的种类有关。例如，脂肪酶催化6-氨基-1-己醇的酰化反应，底物分子中的氨基和羟基都可被酰化，分别生成肽键和酯键。当采用黑曲霉脂肪酶进行催化时，羟基的酰化占绝对优势；而采用毛霉脂肪酶催化时，则优先使氨基酰化。研究表明，在不同的有机介质中，氨基的酰化与羟基的酰化程度也有所不同。■键选择性键选择性与酶的来源和有机介质的种类有关。30■热稳定性许多酶在有机介质中的热稳定性比在水溶液中的热稳定性更好。酶在有机介质中的热稳定性还与介质中的水含量有关。在有机介质中，酶的热稳定性之所以增强，可能是由于有机介质中缺少引起酶分子变性失活的水分子所致。■热稳定性许多酶在有机介质中的热稳定31■pH值特性pH印记：在有机介质反应中酶所处的pH环境与酶在冻干或吸附到载体上之前所使用的缓冲液pH相同。然而，在含有微量水的有机介质中，采用有机缓冲液时，酶分子的pH印记特性不再起作用，即酶在冷冻干燥前缓冲液的pH状态对酶在有机介质中的催化活性没有什么影响，而主要受到有机相缓冲液的影响。■pH值特性pH印记：在有机介质反应32第四节有机介质中酶催化反应的条件及其控制一、有机介质中酶催化反应的类型■合成反应（脂肪酶或酯酶、蛋白酶）■转移反应■醇解反应■氨解反应■异构反应■氧化还原反应■裂合反应第四节有机介质中酶催化反应的条件及其控制一、有机介质中酶33二、酶的选择不同的酶具有不同的结构和特性，同一种酶，由于来源的不同和处理方法的不同，其特性有所差别，所以要根据需要通过实验进行选择。在有机介质中进行催化反应，对酶的选择不但要看催化反应的速度的大小，还要特别注意酶的稳定性、底物专一性、对映体选择性、区域选择性、键选择性等。二、酶的选择不同的酶具有不同的结构和特34三、底物的选择和浓度控制由于酶在有机介质中的底物专一性与在水溶液中的专一性有些差别，所以要根据酶在所使用的有机介质中的专一性选择适宜的底物。酶在有机介质中进行催化，要考虑底物在有机溶剂和必需水层中的分配情况。疏水性强的底物虽然在有机溶剂中的溶解度大，浓度高，但难于从有机溶剂中进入必需水层，与酶分子活性中心结合的底物浓度较低，而降低酶的催化速度。如果底物亲水性强，在有机溶剂中的溶解度低，也使催化速度减慢。三、底物的选择和浓度控制由于酶在有机35四、有机溶剂的选择有机溶剂是影响在有机介质中催化的关键因素之一，在使用过程中要根据具体情况进行选择。通常选用2≤lgP≤5的溶剂作为催化反应介质。在与水混溶的有机介质中，水与有机溶剂混合在一起，组成均一的单相反应体系。在此反应体系中，有机溶剂的含量对酶的催化作用也有显著影响。四、有机溶剂的选择有机溶剂是影响在有机介质中催化的36酶的非水相催化课件37五、水含量的控制六、温度控制七、pH的控制最适水含量与溶剂的极性有关，通常随溶剂极性的增大，最适水含量也增大；而达到最大反应速度的水活度却变化不大，都在0.5~0.6之间。所以水活度能够更确切地反映水对催化反应速度的影响。

酶与其他非酶催化剂一样，温度升高时，其立体选择性降低。缓冲液对冷冻干燥过程中pH值和酶活力的变化有明显影响。五、水含量的控制最适水含量与溶剂的极38第五节有机介质中酶催化的应用第五节有机介质中酶催化的应用39光学活性化合物是指那些具有旋光性质的化合物，它们的化学组成相同，但是立体结构不同而成为恰如人的左右手一样的对映体，因此也称为手性化合物。手性是人类赖以生存的自然界的本质属性之一．对映体的存在是自然界中的一种普遍现象，构成生物体的基本物质，如氨基酸、蛋白质、核酸、糖类等生物大分子都是手性分子。一、手性药物的拆分光学活性化合物是指那些具有旋光性质的40手性？如人体的左右手一样，在空间上不能完全叠合，却能互为镜像的奇特属性，我们称之为“手”性。手性分子？化学中，组成相同但空间结构上互成镜像（对映体）的分子称为手性分子。手性药物？指只含有单一对映体的药物为手性药物。手性？如人体的左右手一样，在空间上41手性药物实际上应该是指只含单一对映体的药物，但是过去手性药物多数是以其消旋体形式(含有等量对映体的混合物)出售。目前世界在1327种全合成的化学药物中约有528种手性药物(约占40％)，但是其中作为单一对映体药物批准上市的仅为手性药物的l0％(约61种)，大多数(467种)是以外消旋体形式销售。手性药物实际上应该是指只含单一对映体42酶的非水相催化课件43■手性药物两种对映体的药效差异手性药物的拆分具有重要意义和应用价值。有机介质中酶催化反应在手性药物拆分的研究、开发方面，具有广阔的应用前景。■手性药物两种对映体的药效差异手性药44■酶在手性化合物拆分方面的应用■酶在手性化合物拆分方面的应用45二、手性高分子聚合物的制备可生物降解高分子是指在一定条件下，能被生物体侵蚀或代谢而降解的材料。可生物降解高分子材料在各个领域的应用前景非常广阔。一般认为．除了一些天然高分子化合物(如纤维素、淀粉)外，只含有碳原子链的高分子(如聚乙烯醇)也是可生物降解的。另外，聚环氧乙烷、聚乳酸和聚己内酯以及脂肪族的多羧酸和多功能基醇所形成的聚合物也是可生物降解的，这里包括聚酯类和聚糖类高分子。二、手性高分子聚合物的制备可生物降46酶的非水相催化课件47用酶法合成可生物降解高分子材料，实际上得益于非水酶学的发展。酶在有机介质中表现出了与其在水溶液中不同的性质，并具有催化一些特殊反应的能力。用酶促合成法开发的可生物降解高分子材料主要包括聚酯类、聚糖类、聚酰胺类等。用酶法合成可生物降解高分子材料，实际上481、可生物降解的聚酯的合成1、可生物降解的聚酯的合成492、聚糖酯类可生物降解高分子的酶促合成糖类衍生物是一种天然的可生物降解化合物，但是它作为可生物降解材料有不尽如人意之处，因而改性天然多糖类也是开发可生物降解材料的重要途径。酶法改性天然多糖的主要途径大多是在聚酯链上引入糖基，以增强聚合物的生物可降解性能。主要合成模式如下；2、聚糖酯类可生物降解高分子的酶促合成50酶的非水相催化课件51三、酚树脂的合成酚树脂是一种广泛应用的酚类聚合物，酚树脂通常在甲醛存在条件下通过酚类物质聚合而成，可以用作黏合剂、化学定影剂等，由于在生产和使用过程中甲醛会引起环境污染，急需寻求一种无甲醛污染的树脂。三、酚树脂的合成酚树脂是一种广泛应用的52辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)在催化合成聚合物方面也是一种应用比较多而且很有潜力的一种酶。它能够以过氧化氢作为电子受体，专一地催化酚及苯胺类物质的过氧化反应。辣根过氧化物酶(horseradis53启始阶段自由基传递阶段自由基聚合阶段启始自由基传递阶段自由基聚合阶段54酶的非水相催化课件55四、导电有机聚合物的合成HRP催化合成的聚合物除了可以作为酚树脂的替代品外，人们更感兴趣的是它在功能材料方面的应用。四、导电有机聚合物的合成HRP催化合成56有机聚合物通常是绝缘体。1977年，麦迪阿米德制备得到碘掺杂的聚乙炔，其导电率达到了金属水平。打破了有机聚合物都是绝缘体的传统观念。此后人们又相继研究出聚吡咯、聚噻吩、聚苯胺等导电聚合物，具有良好的应用前景。有机聚