人类疾病动物模型概述(2016级研究生,2016年9月)

人类疾病动物模型概述

中南大学基础医学院病理生理学系肖献忠一、基本概念1、生物：指一切具有新陈代谢、可生存、生长、繁殖的生命体，包括动物、植物、微生物。2、动物：指多细胞真核生命体，是生物中的一大类群，已知有150多万种，包括人类。3、实验动物：是指经专门培育、供生物医学实验研究使用的动物，要求来源清楚、遗传背景明确、微生物受到控制。4、人类疾病动物模型：是指具有人类疾病模拟表现的实验动物二、人类疾病动物模型的作用和意义

1、避免了在人身上进行实验所带来的风险

临床上对外伤、中毒、肿痛病因等研究是有一定困难的，甚至是不可能的，如急性和慢性呼吸系统疾病研究中很难重复环境污染的作用。辐射对机体的损伤也不可能在人身上反复实验。而动物可以作为人类的替难者，在人为设计的实验条件下可反复观察和研究。因此，应用动物模型，除了能克服在人类研究中经常会遇到的理论和社会限制外，还容许采用某些不能应用于人类的方法学途径，甚至为了研究需要可以损伤动物组织、器官或处死动物。2、可随时复制临床上平时不易见到的疾病如放射病、毒气中毒、烈性传染病,可以根据研究目的要求随时采用实验性诱发的方法在动物身上复制出来。

3、可克服在研究某些潜伏期长、病程长和发病率低的人类疾病时所遇到的困难一般遗传性、免疫性、代谢性和内分泌等疾病在临床上发病率很低，研究人员可以有意识地提高其在动物种群的中发生频率，从而推进研究。如肿瘤等疾病发生发展很缓慢，有的可能要几年、十几年、甚至几十年。有些致病因素需要隔代或者几代才能显示出来，一个科学家很难有幸进行三代以上的观察，而许多动物由于生命的周期很短，在实验室观察多代都是容易的。4、可严格控制实验条件，提高研究的效率和研究结果的可靠性临床上疾病是十分复杂的，各种因素均起作用。病人的年龄、性别、体质、遗传等各不相同，对疾病的发生发展均有影响。采用动物来复制疾病模型，可以选择相同品种、品系、性别、年龄、体重、活动性、健康状态、甚至遗传和微生物等方面严加控制的各种等级的标准实验动物，用单一的病因作用复制成各种疾病，并严格控制温度、湿度、光照、噪音、饲料等实验条件，这样有利于获得可靠的实验结果，提高研究效率。

在各种疾病研究中，同一时期内很难在病人身上取得一定数量的生物样本和数据资料，但在动物模型上容易实现。而且通过限定各种实验条件（如投服一定剂量的药物或移植一定数量的肿瘤等），可获得条件一致的模型材料和数据。5、可以简化实验操作和样品收集动物模型作为人类疾病的“缩影”，便于研究者按实验目的需要随时采取各种样本，甚至及时处死动物收集样本，这在临床是难以办到的。实验动物向小型化的发展趋势更有利于实验者的日常管理和实验操作。

6、有助于更全面深刻地认识疾病的本质临床研究受到诸多限制，不便于采用一些工具药来进行疾病的机制研究，很难进行基因的操作，因此较难开展深入的疾病机制研究。而在人类疾病的动物模型上，可进行不同动物的比较研究和整合分析，可使用各种工具药（如激动剂、抑制剂），并进行各种基因操作（如转基因、基因敲除、基因表达抑制等），有利于从整体、离体、分子细胞等多个水平揭示疾病的发生机制，可使研究工作上升到立体水平来揭示疾病的本质。

因此，利用人类疾病动物模型来研究人类疾病，对理解疾病发生、发展至关重要，对基因功能与疾病关系的分析、疾病发病机制的探讨、药物新靶点的发现及临床前药效学评价等都具有十分重要的作用和意义。但从动物模型获得的结果不能简单类推至人，只能供研究人类疾病参考，其结果还必须在人类疾病中获得验证。三、人类疾病动物模型的分类（一）按制备方法分类1、自发性动物模型（spontaneousanimalmodels）

指不加任何人工诱发，在自然条件下动物自然产生的疾病，或者由于基因突变引起异常表型，通过遗传育种保留下来的动物疾病模型。以肿瘤遗传性疾病居多。优点：在一定程度上减少了人为的因素，更接近自然的人类疾病。缺点：种类有限，疾病动物饲养条件要求高，发病率低，发病时间长。自发肿瘤模型因动物种系、品种不同，其肿瘤所发生的类型和发病机制有差异

自发性动物模型应用价值很高，在遗传性疾病、心血管病、免疫缺陷病、肿瘤等的研究上得到了广泛应用。近几十年来科学界十分重视自发性动物模型的开发。如与人类心脏病相似的加拿大犬；与儿童碳水化合物、氨基酸代谢失调相似的猫；自发性高血压和脑中风大鼠；青光眼兔；自发性糖尿病地鼠；肥胖症小鼠；裸鼠等等。2、诱发性动物模型（inducedanimalmodels）

又称为实验性动物模型，指通过使用物理、化学、生物等致病手段，人为制造的疾病模型。物理因素诱发：如手术切除、外力致骨折、放射线致免疫抑制；化学因素诱发：如高油脂饲料致兔动脉粥样硬化、化学毒物中毒；生物因素诱发：如微生物感染；复合因素诱发：如豚鼠慢支用致病菌加寒冷或加SO2

优点：制作方法简便，实验条件比较简单，其他因素容易控制，短时间内可大量复制。缺点：诱发的疾病模型与自然产生的疾病在某些方面有所不同。而且有些人类疾病不能用人工方法诱发出来。3、基因修饰动物模型（geneticallymodifiedanimalmodels)又称遗传工程动物模型，是指通过转基因、基因敲除、基因敲入、基因敲低等生物工程技术人为改变了动物遗传性状的动物模型，是研究人类基因功能、人类疾病及新药研发的重要工具，反应生命科学的发展趋势，新技术不断产生，日益受到学术界的重视。在本讲座中将做重点介绍。(二)、按疾病种类分类

2、各系统疾病动物模型指模拟人类各系统疾病的动物模型，如神经（大鼠囊状脑动脉瘤）、心血管（小型猪动脉粥样硬化）、呼吸（豚鼠慢支）、消化（轮状病毒性肠炎）、内分泌与代谢（糖尿病）、泌尿等系统的疾病模型。1、基本病理过程动物模型

指模拟各种基本病理过程的动物模型。如发热、炎症、休克、DIC、水电解质代谢紊乱、酸碱失衡等。1、抗疾病型动物模型（negativeanimalmodels）是指特定的疾病不会在某种动物身上发生。因此可借以探讨为何该种动物对该疾病有天然的抵抗力。如哺乳类动物均感染血吸虫病，而洞庭湖流域的东方田鼠却不能复制血吸虫病，故可用于血吸虫感染和抗病的研究。（三）、其它分类2、生物医学动物模型（biomedicalanimalmodels)

是指利用健康正常动物的生物学特征来提供人类疾病相似表现的疾病模型。如沙鼠缺乏完整的脑基底Willis动脉环、动脉环后交通支，左右大脑供血相对独立，可用来结扎一侧颈动脉制备脑梗塞、脑缺血模型；鹿的正常红细胞是镰刀形的，多年来一直用于镰刀形红细胞贫血研究。四、人类疾病动物模型的制备原则1、相似性2、可重复性3、可靠性4、适用性和可控性5、易行性和经济性1、相似性所复制的模型应尽可能与人类疾病相同、相似，能够找到与人类疾病相同的动物自发性疾病当然最好。例如SHR就是研究人类原发性高血压的理想模型，老母猪自发性冠状动脉粥样硬化是研究人类冠心病的理想模型，自发性狗类风湿性关节炎与人类幼年型类风湿性关节炎十分相似等等。与人类完全相同的动物自发性疾病模型毕竟不可多得，往往需要人工加以复制。为了尽量做到与人类疾病相似，首先要注意动物的选择。例如，小鸡最适宜做高脂血症的模型，因它的血浆甘油三酯、胆固醇以及游离脂肪酸水平与人十分相似，低密度和极低密度脂蛋白的脂质构成也与人相似。如果动物模型与临床情况不相似，在动物身上有效的治疗方案就不一定能用于临床。例如，动物内毒性休克（单纯给动物静脉输入细菌内毒素所致的休克）与临床感染性（脓毒性）休克就不完全一样，因此对动物内毒素性休克有效的疗法（如抗炎症因子抗体）不能通过临床试验。2、可重复性理想的动物模型应该是稳定、可重复的，甚至是可以标准化的。例如用一次定量放血法可百分之百造成失血性休克和一定的死亡率，这就符合可重复性的要求。如何增强动物模型复制时的可重复性？注意在以下方面尽量保持一致：动物品种、品系、年龄、性别、体重、健康情况、饲养管理；实验及环境条件、季节、昼夜节律、应激、室温、湿度、气压；实验方法步骤；药品生产厂家、批号、纯度、规格；给药剂型、途径、剂量、浓度；麻醉、镇静、镇痛方法；仪器型号、灵敏度、精确度；实验者操作熟练程度等。3、可靠性复制的动物模型应该力求可靠地反映人类疾病，即可特异地、可靠地反映某种疾病或某种机能、代谢、结构变化，应具备该种疾病的主要症状和体征，经化验或X光照片、心电图、病理切片等证实。例如铅中毒可用大鼠做模型，但有它本身容易患地方性肺炎及进行性肾病，后者容易与铅中毒所致的肾病相混淆，不易确定该肾病是铅中毒所致还是它本身的疾病所致。用蒙古沙土鼠就比较容易确定，因为一般只有铅中毒才会使它出现相应的肾病变。

4、适用性和可控性供医学实验研究用的动物模型，在复制时，应尽量考虑到今后临床应用和便于控制其疾病的发展，以利于研究的开展。如雌激素能终止大鼠和小鼠的早期妊娠，但不能终止人的妊娠。因此，用某些雌激素类药物在大鼠或小鼠研究终止妊娠的作用对人是没有意义的。有的动物对某致病因子特别敏感，极易死亡，也不适用。如狗腹腔注射粪便滤液引起腹膜炎，很快死亡（80%在24小时内死亡），来不及做实验治疗观察，而且粪便剂量及细菌菌株不好控制，因此不能准确重复实验结果。5、易行性和经济性在复制动物模型时，所采用的方法应尽量做到容易执行和合乎经济原则。如灵长类动物虽与人最相近，复制的疾病模型与人类疾病相似性最好，但灵长类动物稀少昂贵，即使猕猴也不可多得，更不用说猩猩、长臂猿。很多小动物如大小鼠、地鼠、豚鼠等也可以复制出十分近似的人类疾病模型。它们容易作到遗传背景明确，体内微生物可加控制，模型稳定，年龄、性别、体重等可任意选择，而且价廉易得、便于饲养管理，因此可尽量采用。除非不得已或一些特殊疾病（如痢疾、脊髓灰白质炎等）研究需要外，尽量不用灵长类动物。除了在动物选择上要考虑易行性和经济性原则外，而且在模型复制的方法、试剂、指标的观察上也都要注意这一原则。五、基因修饰动物模型的制备方法及其研究进展1、转基因动物模型2、基因敲除动物模型（经典方法、条件性敲除）3、基因敲入动物模型4、基因敲低动物模型5、基因修饰技术新进展（ZNF,TALENs,CRISPR/Cas9)1982年华盛顿大学的PalmiterRD将大鼠的生长激素基因注射到小鼠受精卵内,培育出体型明显大于正常小鼠的超级鼠,转基因小鼠A生长速度要比普通小鼠B的生长速度平均快50%，引起轰动。1、转基因动物（transgenicanimal)模型1987年世界上第一只商业化转基因绵羊诞生(英国Roslin

研究所)；1989年精子载体法应用于转基因动物；1997年转基因克隆羊Dolly产生(Roslin研究所)，携带人凝血因子Ⅸ；1999年上海遗传研究所宣布转基因试管牛“滔滔”诞生

三十多年来，转基因动物技术飞速发展，转基因兔、转基因猪、转基因牛、转基因鸡、转基因鱼等陆续育成。转基因动物技术已广泛应用于生物学、医学、药学、畜牧学等研究领域。转基因鼠转基因动物的概念

将外源基因导入胚胎细胞并整合到基因组，使动物获得一个基因并能稳定遗传给后代的一类动物。

（传统的转基因动物：外源基因随机整合,拷贝数不定)转基因动物制备原理

转基因的基本方法显微注射法逆转录病毒法ES（胚胎干细胞）法精子载体法脂质体载体法电脉冲法基因枪法体细胞核移植技术（转基因克隆技术）

1、显微注射法显微注射仪拉针仪煅针仪体视镜受精卵的采集受精卵的消化、培养消化、洗涤后的受精卵原核清晰的受精卵注射前注射后（3）受精卵的显微注射注射中受精卵的移植2、逆转录病毒法Retrovirus是只有一条单链RNA的病毒类的总称。逆转录病毒在逆转录酶（RT）的作用下可以将本身的单链RNA作为模板进行复制和遗传信息的传递。逆转录病毒通过病毒中膜糖蛋白和宿主细胞表面的受体相互作用而进入宿主细胞。原理逆转录病毒具有高效感染和在宿主细胞DNA上高度整合的特性。逆转录病毒能作为目的基因的载体，通过感染早期胚胎细胞实现基因转移，产生嵌合体动物，再经过杂交、筛选即可获得转基因动物。人或动物的胚胎中均存在一些具有高度更新能力和多向分化能力但尚未分化的干细胞，称胚胎干细胞（embryonicstemcell，ES）。它与早期胚胎聚集，或被注射到胚胎后，能参与宿主胚胎的发育，形成包括生殖细胞在内的所有组织。3、胚胎干细胞介导法（ES细胞法）原理将外源目的基因导入ES细胞，再移入囊胚期的宿主胚胎，最后将宿主胚胎移植到假孕母鼠子宫内，便可获得由胚胎干细胞介导的转基因动物。关键步骤①ES细胞的分离培养②ES细胞基因操作：电穿孔、显微注射、磷酸钙-DNA共沉淀、逆转录病毒感染等方法③获取囊胚期胚胎④显微操作：ES细胞注射到囊胚期胚胎内⑤胚胎移植优点：整合率相对较高可导入基因片断较长外源基因整合于所有的组织细胞中的概率高缺点：随机整合有些原核看不清，需经特殊处理才能有效导入需较精密仪器，费用昂贵显微注射法三种转基因方法优缺点比较优点：胚胎存活率高病毒DNA随机单拷贝整合宿主范围广

缺点：整合率不高，整合位点是随机的后代多为嵌合体动物外源基因易发生重排或丢失病毒载体容量不大病毒DNA序列可能会干扰外源基因的表达逆转录病毒法

优点：整合可控可用多种方法将外源基因导入ES细胞，其细胞的鉴定和筛选比较方便ES细胞注入囊胚及囊胚移植到子宫的操作比较简便

缺点：ES细胞系培养、保存和维持不易后代多为嵌合体所需时间较长ES细胞法

应用价值研究基因的结构和功能及其表达与调控建立人类疾病动物模型研究人类疾病基因治疗研制生物反应器扩大移植供体来源改良动物品种

2、基因敲除动物模型（经典方法、条件性敲除）基因敲除动物（geneknock-outanimal)是指通过同源重组，在细胞中定点敲除某个基因，使之不能表达，并能遗传给子代的一类动物。结合了基因工程、干细胞工程、生殖工程三大技术的优势，是上世纪80年代发展起来的受到全球科学家关注的一项新技术。1981年小鼠胚胎干细胞系建立（EvansMJ)；1985年发现同源重组（SmithiesO)；1989年首个基因敲除小鼠产生（SchwartzbergPL)。主要步骤：基因打靶载体构建、干细胞与生殖工程操作、基因型与表型观察2007年获得诺贝尔生理学或医学奖OliverSmithies美国北卡来纳大学生化与分子生物学教授，发现同源重组技术。MarioR.Capecchi美国犹他大学遗传学教授，发现同源重组技术。MartinJ.Evans英国加的夫大学遗传学教授，发现胚胎干细胞建系、培养、操作等技术。基因打靶载体的构建HSF1基因打靶载体构建示意图胚胎干细胞（ES)与胚胎操作基因型与表型的观察FEMALEMALE+/+-/-+/+-/-3.HSF1基因敲除XiaoXZ,etal.EMBOJ,18(21):5943-52.1999条件性基因敲除（conditionalgeneknockout)条件性基因敲除主要通过Cre/loxP或者Ftp/FRT重组系统来实现。Cre/loxP系统

Cre/loxP系统来源于F1噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。该系统含有两种成分：①一段长34bp的DNA序列，含有两个13bp的反向重复序列和一个8bp的核心序列，称为loxP位点；②Cre重组酶，它是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白，可以引发loxP位点的DNA重组。当一段DNA序列位于两个loxP位点之间的时候，在Cre重组酶的作用下，这段序列可被删除(当两个loxP位点的方向相同)，或者方向发生倒转(当两个loxP位点的方向相反)。

利用Cre/loxP系统进行条件性基因敲除，需要两只转基因小鼠。第一只小鼠通过同源重组技术将loxP位点分别置于目的基因的两端；第二只是转基因小鼠，将Cre重组酶置于某特定基因启动子的调控之下，可以使其在某特定组织或诱导物存在的条件下表达。最后，让这两只小鼠进行交配，所产生的同时含有上述两种基因型的子代小鼠就会在某一特定类型的组织细胞或在诱导物作用下缺失某特定基因。Cre/loxP系统的作用机制3、基因敲入动物（geneknockinanimal)即通过同源重组技术将外源基因定点整合到宿主基因组中，且拷贝数确定，解决了传统转基因动物制备中随机整合、拷贝数不定的缺陷。4、基因敲低动物(geneknock-downanimal)

即表达RNAi的转基因动物。通过随机或定点敲入的方式将某种siRNA基因整合至基因组，利用RNAi机制调低动物中某种基因的表达水平。与基因敲除动物相比，制备更为简单、快速、经济。5、基因修饰技术新进展（ZFN,TALENs,CRISPR/Cas9)经典方法：经典的基因敲除技术：由细胞自身进行随机双链断裂和同源重组，发生几率低(~1/106cells），再靠正负筛选来获得同源重组细胞。基因修饰新技术：采用特异的DNA识别域+核酸酶，在特定的DNA位点切断DNA，形成双链断裂，大大改善了同源重组的效率，实现对基因组进行更加精确、有效的改造。实现染色体DNA序列的人工编辑修改点突变：Silent，Missense，Nonsense，Frameshift（基因敲除）片段删除片段插入目的与用途：疾病模型制备、基因功能研究、基因治疗等基因修饰新技术解决传统的挑战（1）ZFN技术锌指核酸酶（Zinc-fingernucleases,ZFN）是人工改造的限制性核酸内切酶，利用不同的锌指结构识别特异DNA序列，利用核酸酶切断靶DNA。锌指结构中的两个半胱氨酸可与另两个半胱氨酸（C）或组氨酸（H）一起与锌离子络合而形成指状结构，每一个指状结构可特异识别3-4个碱基；人工设计识别特异DNA序列的锌指结构采用如上的通用序列，通过改变其中7个X来实现识别不同的三联体碱基，TGEK是多个螺旋间的连接序列；构建成对人工锌指结构域和FokI融合蛋白（ZFN）可以在指定区域切断DNA双链。锌指核酸酶介导的定向染色体删除研究人员可以利用ZFN技术进行各种基因编辑，比如基因敲除。已建立有ZFN库，识别多种DNA序列，但还不能达到识别任意靶DNA的目的，其应用受到一定的限制。（2）TALEN技术概念：转录激活子样效应子核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TALENs)。最初在植物病原体黄单胞菌属中发现，即某些多肽能特异性结合到宿主基因的某个位点从而激活该宿主基因的表达

。与ZFNs相比，TALENs的DNA识别序列更长，故脱靶效应的几率较小，现已应用于细胞、酵母、斑马鱼、大鼠、小鼠等各类研究对象。技术原理：表达一个重组核酸酶，在靶点识别结构域的作用下，核酸酶发挥内切酶活性，从而打断目标基因，完成基因敲除的过程。1989年植物病原体黄单胞菌属（Xanthomonasspp.）avrBs3基因被克隆。2007年发现其具有序列特异性核酸结合特性，avrBs3–TA2009年XanthomonasTA氨基酸序列与核酸靶序列的对应关系被破译由34个aa组成一个单元模块，重复14-18次

34个aa中的第12和13个氨基酸（RepeatVariantDi-residue,RVD)对应识别一个目标碱基

TALEN发展过程N-天冬酰胺;I-异亮氨酸;H-组氨酸;D-天冬氨酸;G-甘氨酸人工构建TALE模块识别指定核酸序列102碱基模块单元……14–18个重复真核表达……14–18个重复特异识别指定的14-18个核酸序列并与之结合34氨基酸单元TALEN(TALE+FOKI)表达质粒对构建TALEN基因敲除X2TALEN表达质粒对的转染、表达和靶位点切割双链断裂诱发DNA损伤修复机制（nonhomologousend-joining，NHEJ）。由于在此修过程中总是有一定的错误率存在。在修复中发生移码突变的个体即形成目标基因敲除突变体TALEN介导的同源重组同源重组发生率升高几个数量级DonorplasmidHRDonorplasmidDonorplasmid基因敲入RightarmLeftarm片段删除RightarmLeftarm点突变2011年8月，NatureBiotechnology上同时发表了用TALEN技术进行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇综述。一篇人类干细胞《GeneticengineeringofhumanpluripotentcellsusingTALEnucleases》一篇大鼠《KnockoutratsgeneratedbyembryomicroinjectionofTALENs》两篇斑马鱼《TargetedgenedisruptioninsomaticzebrafishcellsusingengineeredTALENs》

《HeritablegenetargetinginzebrafishusingcustomizedTALENs》一篇综述《MoveoverZFN》TALEN技术新进展TALEN靶向（基因敲除）技术基本流程1.选择、确定靶点2.TALE识别模块串联构建3.TALEN真核表达质粒构建4.TALEN真核表达质粒转入（卵）细胞，表达TALEN重组蛋白5.检测突变效率，筛选（移码）突变体X2X2X2靶点的DNA序列特征：相隔17-18bp的两段14-18bp序列作为靶点参考文献：Cermaketal.,EfficientdesignandassemblyofcustomTALENandotherTALeffector-basedconstructsforDNAtargeting,NucleicAcidsResearch,2011,Vol.39,No.12,e82.在线靶点选择设计软件：/node/add/talef-off/选择确定TALE靶点

TAL的核酸识别单元为34aa模块中的双连氨基酸（RVD）

RVD与A、G、C、T有恒定的对应关系，即NI识别A，NG识别T，HD识别C，NN识别G，非常简单明确欲使TALEN特异识别某一核酸序列（靶点），只须按照靶点序列将相应TAL单元（14-18个）串联克隆即可。TALE识别模块串联构建具专利保护的克隆构建系统步骤一：靶点识别单元串联步骤二：TALEN表达质粒构建将靶点识别模块克隆入真核表达载体，得到Talen质粒对

靶点识别模块串接成功后