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欧阳与创编欧阳与创编2021.03.08欧阳与创编欧阳与创编2021.03.08冰冻切片是指将组纟只在冷冻状怒下貢接用切片机切片。它实际上是叹水为包埋剂，将组纟尺逬行冰冻至坚硬后切片的。在冰冻切片前组织不经过任何7匕学药晶处理裁加热过程,大大缩短了制片时间。同时，由于此法不需要经过脫水、透明和浸蜡等步骤，因而较适合于脂肪、神经组织和—各组织T匕学的制片，养乍为快速切片的方法应用在搐床珍断。时间：2021.03.时间：2021.03.08创作：欧阳与1.取材:应尽可能恢也采取新鲜的材料，彷止组织发生死后变T匕。速冻：为T较好也保存细腮內的酶话牲改尽快制庆切片标茶的需要，〜股在取材后就要云刻对组织块迸行建冻,茨组织温度骤降，缩短降温的时间，喊少冰晶的形庆。液氮速冻切片法是实验室最常用的速冻切片方法。具体做法是将组织块平教于钦塑瓶葢茨特制小盒內C直在约2cm丿，如组织块小可适量力口OCT包埋剂浸坎组织，然后将特制小盒韻缓平放入盛有液氮的小杯內，为盒庶郃接触液氮时即开绐乞化沸腾，此时小盒保荷原辰切乡浸入液氮中，大约10-20S组织即迅速冰结庆块。在制庆冻块后，即可置入惶冷箱切岸机冰冻切片。若需要保存，应快速叹钮箔或塑料薄膜封包，云即置入-80°C冰箱贮存备用。固定：样品托上涂—层OCT包埋胶，将建冻组织置于其上，4°C冰箱预冷5-10minitOCT胶漫透组织。取下组织置于錫箔玄者玻岸上，样晶托速冻。组织置于样品托上，其上再添—展OCT胶，叹宪全覆葢为宜，速冻架(PE)上30mino切岸：惶温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其烹茶结构是将切岸机置于低温密闭室內，枚切岸时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5・10pm。切片时，低温室內温度叹・15°C〜-20°C为宜，温度过低组织易陂碎，筑卷板的辰置及角度契适当，载玻片附贴组织切片，切多上下移动。切好室温放置30min后，入4°C丙酮固定5〜lOmin,焼箱干燥20minoPBS洗5minx30进行抗原热修蒙，微波热修夏也可，室温自然冷却。可用3%H2O2孵育5〜lOmin,消除內源惟辽氧丫匕牛多酶的话牲。免疫荧充染匡：冰冻切岸室温晾干15min,可用舍10%正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时C此步刁不洗丿滴加适当比例稀释的〜筑茨—抗工佑液(抗体的量稅组织大小而定，原则是可叹均勻覆葢组织面，且保证整个辽程中不会废组织干涸)，将切片放在PBS的免疫组丫匕握盒，室温孵育2小时茨4°C辽夜。弟二天先将湿盒放到37°C回温lh,然后吸取岸上的—抗迸行回收，将切片插入到小染缸PBS冲洗。滴加用PBS稀释好的二抗C避充丿置于分子杂交箱中37°C孵育1小时。回收二玩，切片置于染缸內，PBS洗5minx3次。滴加DAPI工乍液染核，室溫10・20min（工年浚度0.1%染匡15min）o回收DAPI,滴加5-10（.11抗荧死衰痢封炖剂茨中性树胶,用处理干净的葢玻岸封片，即可彩荧

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