不同炮制时间蜂粮的ph值和花粉活力测定

不同炮制时间蜂粮的ph值和花粉活力测定

大多数蜜蜂（采集蜂蜜营养）储存在蜜蜂总科中（吴艳如，2000）。蜂粮也称蜂面包、蜂巢花粉,是以花粉为主要原料酿制而成,作为蜜蜂幼虫的食料(缪正瀛,2000;吴燕如,2000;Nagaietal.,2004;嵇保中等,2006)。贮备的蜂粮在巢房中有一个复杂的微生物区系变化和生物化学变化过程(袁耀东,1991;苏松坤,2000),一个重要的特征是酸度增强,一般新鲜的蜂花粉pH值大约为7.2,酿贮成熟的蜂粮pH值一般减少到3.4～4.2(Isidorovaetal.,2009)。新鲜茶蜂花粉的pH值为5.63,1日龄蜂粮的pH值降低到4.33,15日龄蜂粮的pH值降到最低,为3.84,呈酸性(苏松坤等,2002)。蜂粮与新鲜蜂花粉相比,具有良好的耐贮存性。耐贮存性与蜂粮本身的pH值降低有关(Fujiwaraetal.,1990;Gilliametal.,1997;苏松坤,2002)。大多数细菌所要求的最适pH为6.5～8.0,引起伤口感染的金黄色葡萄球菌的最适pH值为7.0～7.5(郭善利,1998)。因此,蜂粮在酿制后期的酸性物质和酸性空间不利于细菌的生长和繁殖,从而可以大大延长其保质期。蜜蜂蜂粮酿制过程中,花粉很快失去萌发力,从而延长蜂粮的新鲜度和保质期。苏松坤等(2002)采用氯化三苯基四氮唑(TTC)花粉活性测定法测定蜜蜂茶花粉蜂粮样品中花粉粒的活力。在酿制过程中随酿制时间的延长花粉逐渐失去活力,在第5d花粉生活力完全失去活性。有报道蜂粮中花粉失去萌发力是因为在蜜蜂酿贮蜂粮的过程中加入了唾腺分泌物10-羟基-2-癸烯酸(10-hydroxy-2-decylennicacid,10-HDA),在10-HDA的作用下花粉粒很快丧失了发芽力;有报道10-HDA对植物的花粉萌发、花粉管伸长和生殖核的有丝分裂有强烈的抑制作用(许雅香等,2000);但是,茶花粉蜂粮中没有检测到10-HDA(苏松坤,2000)。长木蜂Xylocopatranquebarorum(Swederus)属于林业生态系统中的野生蜂类,其蜂粮在巢室中能长期自然放置并保持新鲜状态而不变质(罗禄怡等,1992;贺春玲等,2009)。关于长木蜂蜂粮在酿制过程中pH值的变化和酿制的不同阶段花粉活力状况在国内外均未见报道,我们在明确了长木蜂蜂粮的酿贮过程和蜂粮的采集最佳时期后(贺春玲,2009),对长木蜂酿制过程中的pH和花粉活力进行测定和报道,为进一步揭示长木蜂蜂粮的防腐机理提供科学依据。1材料和方法1.1花溪园,南邻玄武湖,东财务金山南京情侣园花卉公园。该公园位于南京城北,南邻玄武湖,东枕紫金山,园内花卉种类繁多且规模较大。其位置与南京林业大学毗邻,试验采集和观察均很便利。1.2样品采集1.2.1植物花粉的采集2008年3月下旬～5月下旬,在南京情侣园花卉公园根据长木蜂采访的植物种类,在植物的盛花期采集已经盛开的植物花粉,用无菌的镊子取其花粉放入灭菌的5mL离心管中,低温条件下带回实验室,4℃保存备用。采集的植物花粉有:紫藤Wisteriasinensis、芍药Paeonialactiflora。1.2.2木蜂花粉的制备长木蜂花粉是指长木蜂将采集的花粉卸巢后,未进行吐蜜湿润前的花粉。采集对象:主要为芍药长木蜂花粉和紫藤长木蜂花粉。采集方法:将标记的供长木蜂筑巢的竹竿捆绑在芍药园和紫藤藤架附近,待长木蜂营巢和正常采粉,将竹竿带回实验室,无菌操作室解剖长木蜂巢室,用无菌的长柄药勺取出卸入巢内的花粉,放入灭菌的5mL离心管中,4℃保存备用。1.2.3采集蜂粮的方法将解剖巢室获得的蜂粮放入已灭菌干燥的150mL广口瓶中。根据卵的新鲜程度和长木蜂酿制蜂粮的进度,判断蜂粮的日龄。将产卵一致的蜂粮放在同一广口瓶中,用无菌的玻璃棒将采集到的蜂粮搅拌均匀,压实,用封口膜密封,室温放置备用。未产卵的蜂粮定为0日龄蜂粮;雌蜂已经在蜂粮上产卵,且卵为乳白色表面有鲜亮光泽,雌蜂向外制作的巢室隔板尚未完成(天气晴好的条件下),此时的蜂粮定为1日龄蜂粮;然后每天定时从1日龄蜂粮中取样,分别标记为2、3、4……40日龄蜂粮。按照上述方法,在2008年4月下旬采集了紫藤花粉、紫藤长木蜂花粉和不同酿制阶段的蜂粮;在2008年5月1日和5月4日分别采集了芍药花粉、芍药长木蜂花粉和不同酿制阶段的蜂粮。1.3花粉纯度的测定采用镜检计算法(徐景耀和庄元忠,1991)检测芍药(紫藤)花粉、芍药(紫藤)长木蜂花粉及不同酿制阶段芍药(紫藤)长木蜂的花粉纯度。具体方法:用无菌镊子从各样品中取少量的花粉放入滴有200μL灭菌水的凹面载玻片的凹槽内,用镊子轻轻地将花粉搅拌均匀,立即观察各样品花粉的纯度。每样品3个重复,每样品随即观察6个视野,共观察18个视野。用显微拍照系统进行拍照,统计不同样品的花粉纯度,以观察到的18个视野的花粉纯度百分数的平均值作为该样品的花粉纯度。1.4样品处理及配制将2008年5月1日采集的样品和从其样品中连续取样的样品记为样品1,5月4日采集的样品和从其样品中连续取样的样品记为样品2。分别称取样品1、2中的芍药花粉、芍药长木蜂花粉、0、1、2、3、……15、20、30、40日芍药蜂粮样品各300mg于干净的10mL离心管中,加入2.7mL去离子水,用漩涡振荡器充分摇匀,用pH计直接测定两次样品溶液的pH值,每样品重复测定3次,取平均值。两次样品的平均值的平均值即为该样品的pH值(苏松坤等,2002)。1.5花粉管长度和温度对菌的影响用移液枪取200μL无菌水滴入灭菌凹面载玻片的凹槽内,用无菌的镊子将不同样品的花粉均匀地洒在水滴上,放在无菌的培养皿中,置于25℃的恒温箱内保湿培养,12h后观察花粉萌发和花粉管生长情况。花粉管长度为花粉粒直径一半以上记为萌发,每处理2重复,每重复随机观察5个视野,每个视野的花粉粒数均在80个以上。花粉管长度的观测,是在显微镜下用测微尺测量花粉管的长度(样本数10)。花粉萌发率(%)=(萌发花粉数/总花粉数)×100。1.6仪器测试数据采集采用多功能型全自动菌落/显微图像分析仪进行;采用MicrosoftExcel表格处理软件和SPSSBaseVer13.0统计软件进行数据统计分析。2结果与分析2.1不同日龄蜂粮样品的花粉纯度差异长木蜂在贮备蜂粮期间,采集的花粉、蜂花粉和蜂粮之间花粉的纯度变化如表1～3。紫藤花粉系列:紫藤长木蜂花粉与不同日龄的蜂粮样品之间的花粉纯度差异显著,而不同日龄的蜂粮样品之间的花粉纯度差异不显著,紫藤长木蜂花粉的纯度最高为100%(表1)。芍药花粉系列:芍药长木蜂花粉的纯度最高,为(95.5±4.61)%,不同日龄蜂粮样品的芍药花粉纯度均在93%以上,通过方差分析结果表明芍药长木蜂花粉和不同日龄的蜂粮样品之间的花粉纯度差异不显著(表2、表3)。长木蜂采集紫藤花粉酿贮的蜂粮中的花粉纯度略高于采集芍药花粉酿贮的蜂粮中的花粉的纯度。林间观察发现,长木蜂在贮备蜂粮期间采集花粉的植物种类比较集中,不随意更换。2.2ph测量的结果2.2.1样品的ph值测定对样品1和样品2中的手采新鲜的芍药花粉、芍药长木蜂花粉、0、1、2……40日龄的长木蜂蜂粮样品的pH值测定结果见表4,样品1和样品2中的芍药花粉、芍药长木蜂花粉和不同酿制时间的蜂粮样品,其pH值变化趋势一致,对于同一日龄条件下不同采集时间的样品其pH值差别不大。2.2.2蜂粮的ph值测定手采新鲜芍药花粉、芍药长木蜂花粉、0、1、2、3、4、5、6、30、40日龄蜂粮的pH值,结果见图1。结果表明,长木蜂芍药蜂花粉贮存在巢房以后,其pH值随蜂粮日龄的增加而降低,芍药花粉的pH值为6.19,芍药长木蜂花粉的pH值为5.92。0日龄蜂粮和1日蜂粮的pH值相同,均为5.82;从蜂花粉到蜂粮,pH值有所下降,但降低趋势不明显。2日蜂粮到3日蜂粮pH值从5.57降到4.84,降低趋势明显,3日以后蜂粮pH值逐渐下降,15日蜂粮的pH值为4.25,20日蜂粮的pH值为4.17,30日蜂粮的pH值为4.06,40日蜂粮的pH值为4.05,30日之后蜂粮pH值基本稳定不变。2.3花粉粒活力测定结果2.3.1花粉管长度变化手采芍药花粉、芍药长木蜂花粉、1日、2日、3日、4日蜂粮样品中花粉粒活力分别为46.76%、26.12%、6.73%、5.12%、0、0(表5)。从1日龄基本丧失萌发力,3日龄以后没有发现有活力的花粉粒。芍药花粉的长木蜂粮,1日龄花粉粒就基本丧失了萌发力,3日龄以后未发现有活力的花粉粒。芍药长木蜂蜂粮在酿制过程中花粉管长度差异明显,手采芍药花粉的花粉管长度为(27.39±12.24)μm,芍药长木蜂花粉的花粉管长度为(13.12±3.81)μm,1日龄蜂粮和2日龄蜂粮中花粉的花粉管长度分别为(4.65±4.27)μm和(4.26±2.55)μm。由花粉萌发率和花粉管长度的结果可以看出,芍药长木蜂蜂粮在酿贮过程中,芍药花粉的花粉粒萌发和花粉管生长均收到很大抑制,花粉萌发活性很快丧失。2.3.2花粉管长度的变化不同样品的花粉活力测定结果见表6。手采紫藤花粉、紫藤长木蜂花粉、1、2、3、4日蜂粮样品中花粉粒活力分别为38.91%、10.58%、4.07%、3.15%、0、0;紫藤长木蜂蜂粮在酿制过程中,不同样品的花粉萌发的花粉管长度差异明显,手采紫藤花粉的花粉管长度为(57.18±23.13)μm,紫藤长木蜂花粉的花粉管长度为(12.7±8.6)μm,1日龄蜂粮和2日龄蜂粮中花粉的花粉管长度分别为(4.67±4.09)μm和(4.27±3.93)μm。其花粉活力的变化趋势和2.3.1中芍药花粉系列的变化趋势基本一致。3结论和讨论3.1不同艺术类型的花粉纯度检测不同粉源的蜂花粉,其营养成分和其它性质相差甚远,所以样品中花粉纯度高低会影响试验结果的准确性(苏松坤,2000)。Gilliam(1989)对杏仁花的手采花粉、蜂花粉和1、3、6周蜂粮样品进行细菌、酵母菌和霉菌的分离试验前,根据花粉粒的颜色和大小,对杏仁花粉蜂粮中的花粉纯度进行检测,其蜂粮中杏仁花粉的纯度为99.8%。苏松坤(2000)在蜂粮的酿制机理和营养价值研究中,对茶花粉蜂粮中茶花粉的纯度进行了检测,结果蜜蜂茶花粉蜂粮在不同酿制阶段的花粉纯度均在91%以上,并且不同酿制阶段蜂粮样品中花粉纯度没有明显差异。长木蜂属于多访花性蜂类,根据植物不同花期而改变访花植物类型,本实验分别以紫藤花粉和芍药花粉作为研究对象,分析了长木蜂在贮备蜂粮过程中花粉纯度。紫藤花粉为扁球形,大小为33(±0.5)×23(±0.5)μm,具3孔沟,沟长,外壁纹饰为桔皮状,且有凹陷(胡蕙露,2001)。芍药花粉呈淡黄色,大部分为正常规则的大花粉,少数为异常不规则的小花粉。正常花粉粒的赤道面观呈长矩圆形,两极大多数呈平截形,少数为圆弧形和圆尖形等;极面观为近三角形,具3孔沟,沟很长。花粉粒表面具网状或小孔状纹饰,网孔大小不一致,且网孔直径均从赤道轴到两极逐渐递减,大部分网纹较平滑,少数较粗糙(金飚等,2005)。镜检结果显示,不论长木蜂是采集紫藤花粉还是芍药花粉酿制蜂粮其花粉的纯度都较高,均在93%以上,紫藤花粉的纯度相对高于芍药花粉的纯度,可能是紫藤植物属于藤本植物类型,花架较高,开花早,其它花粉通过空气的流动受感染的可能性要小;而芍药植物属于小灌木,植株较矮,开花期和其它很多植物的开花期相一致,因此受其它花粉植物的感染可能性也较大,但在观察中发现,长木蜂在贮备同一块蜂粮过程中采集花粉不仅具有专一性,并且独栖性的长木蜂贮备蜂粮由雌蜂独立完成,这可能是长木蜂蜂粮中花粉纯度较高的另一原因。3.2不同日龄蜂粮的ph值分布情况长木蜂蜂粮的pH值随酿制时间的延长而逐渐减小,其研究结果与苏松坤(2002)研究蜜蜂茶花粉蜂粮的pH值变化结果相一致,但样品测定过程中,0日龄蜂粮pH值,样品1为5.67,样品2为5.97;2日龄蜂粮pH值,样品1为5.72,样品2为5.41;两次样品pH值的差值相对较大,初步分析该误差与取样有关,长木蜂在筑巢后,我们对巢口进行标记,从标记开始计算长木蜂酿贮蜂粮的时间,但不同的雌蜂在酿贮蜂粮的时间以及采集粉蜜用时都有显著差异(贺春玲等,2009),0日龄蜂粮为雌蜂未产卵的蜂粮。在取样时,0日龄蜂粮样品很难把握长木蜂的酿制进度,雌蜂完成蜂粮团块大小不同,蜂粮在巢室中存贮时间的差异,从而导致0日龄蜂粮pH值出现误差。2日龄蜂粮是将采集的1日龄蜂粮进行搅拌、压实后,定时从中取得,在搅拌和压实时认为操作,不好把握搅拌的轻重和压实的松紧度,有可能由于此原因导致的,但有关具体原因还有待进一步研究。环境的pH值与微生物生命活动有着密切的关系,环境pH值不同,会造成生物膜电荷的改变,进而引起膜离子通透性变化,从而影响微生物的生长发育(苏松坤,2000)。一般而言,酸性环境有利于物质保存。本文的研究结果表明,长木蜂蜂粮酿制过程中的快速酸化,可能是蜂粮能长期保鲜的重要原因之一。其研究结果与苏松坤(2002)的研究结果相一致,苏松坤(2002)采用从茶蜂粮中分离出的优势细菌进行接种试验,发现酿制初期的优势细菌(如植