当归酰天芥菜定对-L1210-HepG2和HCC细胞的抑制作用

当归酰天芥菜定对L1210，HepG2和HCC细胞的抑制作用【摘要】目的:研究当归酰天芥菜定的抗肿瘤活性及机制.方法：通过细胞生长曲线的绘制，分析AH对L1210细胞的抑制作用；通过MTT比色法，测定AH对L1210，HepG2和HCC细胞的抑制率；通过流式细胞术检测AH对L1210细胞周期的影响.结果：在AH作用下，L1210细胞生长曲线斜率和最大生长密度降低.AH80mg・L-1对L1210细胞的抑制率为%；AH320mg・L-1对HepG2和HCC细胞抑制率分别为%和%.FCM检测表明，AH80mg・L-1作用24h后，L1210细胞的G2M期细胞明显增加.结论：AH对L1210细胞有一定的抑制作用，对HepG2和HCC细胞抑制作用较差.AH对L1210细胞的抑制作用发生在细胞周期的G2M期.

【关键词】当归酰天芥菜定；L1210细胞；HepG2细胞；HCC细胞；MTT法；流式细胞术；细胞周期

0引言

菊科狗舌草属植物狗舌草在民间被用于治疗白血病［1］.陈进军［2］研究发现，狗舌草600mL・L-1乙醇提取物对L1210细胞有抑制作用，并推断该作用可能来自狗舌草中含有的生物碱等成分.为了进一步弄清狗舌草的有效成分，我们对狗舌草的生物碱成分进行了分离和鉴定，并研究了狗舌草中主要生物碱当归酰天芥菜定对白血病L1210及肝癌HepG2和HCC细胞的作用，现报告如下.

1材料和方法1材料植物材料狗舌草于199908采自陕西省陇县关山牧场，经西北农林科技大学生命科学学院植物研究所高级实验师杨金祥予以鉴定.经过溶剂萃取、硅胶柱层析和制备性薄层层析从狗舌草中分离得到AH；薄层层析和气相色谱质谱联用检测，AH为纯净的单体化合物；质谱、红外光谱及核磁共振碳谱对AH的结构进行了确认(Fig1).L1210，HepG2和HCC细胞由第四军医大学实验动物中心提供.酶联免疫检测仪，DG5031型，国营华东电子管厂；流式细胞仪，EpicsELITEESP型，Coulter公司.MTT和DMSO，Sigma产品；RPMI1640培养基，Gibco产品；其余试剂为国产分析纯.

图1当归酰天芥菜定的结构(略)2方法生长曲线绘制取对数生长期的L1210细胞调密度至6×106・L-1，接种于培养瓶内，50mL・L-1CO2,37℃培养.24h后加入用生理盐水稀释的AH，使其终浓度分别为40,80,160和320mg・L-1，另设一个生理盐水对照组.重复1次.从加药之日起连续记数7d，绘制出生长曲线.法测抑制率将L1210细胞调密度至1×106・L-1，96孔培养板每孔加入细胞120μL；HepG2细胞调密度至5×108・L-1，每孔加入200μL；HCC细胞调密度至5×107・L-1，每孔加入200μL.培养24h后，加入AH，使其终浓度分别为80,160和320mg・L-1，每种细胞、每个浓度平行处理3孔，另设生理盐水对照组及只加培养液不加细胞的调零孔.培养2d后，加入5g・L-1MTT，每孔20μL，再培养4h后，小心抽出培养液，加入200μLDMSO，振荡，10min后，490nm酶联免疫仪比色，经调零孔调零，测吸光度值.抑制率=［/对照组A值］×100%.流式细胞术检测细胞周期取对数生长期的L1210细胞5×105个，用培养液配为9mL，培养24h后，加入1mLAH，AH终浓度为80mg・L-1，继续培养.24h后，将细胞离心，PBS洗涤2次，700mL・L-1冷乙醇固定，4℃冰箱过夜.送检前用PBS洗2次，DNAprepkit染色20min，流式细胞仪检测.每个样品计数2×105个细胞，经PhoenixMulticycle软件处理.

统计学处理:以上各方法所得数据，在判断试验组和对照组差异是否显着时，采用t检验进行处理.

2结果

AH各浓度组的生长曲线均在生理盐水组右下方，斜率和最大生长密度降低，显示了AH对L1210细胞的抑制作用(Fig2).利用MTT法测得生理盐水对照组及AH各浓度组的A值和抑制率，对L1210细胞，AH80,160及320mg・L-1与生理盐水对照组的A值差异极显着，其抑制率分别为%,%和%；对HepG2及HCC细胞，AH80mg・L-1和160mg・L-1与对照组无显着差异，320mg・L-1与对照组差异极显着，该浓度对HepG2和HCC细胞抑制率分别为%和%.AH80mg・L-1作用24h后，L1210细胞与对照组相比，G2M期细胞增多，出现G2M周期阻滞.

图2加入AH后L1210细胞生长曲线(略)

表1AH对肿瘤细胞的抑制率(略)

图3对照组L1210细胞的细胞周期(略)

3讨论

从以上结果可看出，AH对L1210细胞有一定的抑制作用，80mg・L-1浓度可产生作用.AH对HepG2和HCC细胞抑制作用较差，只在浓度320mg・L-1

图4AH80mg・L-1组L1210细胞的细胞周期(略)

时才有作用.实验证实了AH是狗舌草抗白血病细胞的有效成分之一.

在细胞生长周期中，存在着两个调节细胞周期正常进行的关键点，即G1S和G2M期，肿瘤细胞抑制剂通常在这两个时期对肿瘤细胞发挥抑制作用，如杀尔威辛对K562细胞［3］、CyclinD1反义核酸对A375细胞［4］、木黄酮对人垂体腺瘤细胞［5］及全反式维甲酸对SMMC7721细胞［6］和QBC939细胞［7］的抑制作用发生在G1S期，而姜黄素(Curcumin)可将SMMC7721细胞和人口腔鳞癌细胞阻断在S/G2M期［8］，逆转录酶抑制剂阻断HO8910细胞于G2M期［9］.本研究发现，AH对L1210细胞生长周期的阻滞发生在G2M期，这可能是其抑制L1210细胞生长的作用机制.从结构上讲，AH属于双稠吡咯啶生物碱，部分PAs具有抗肿瘤活性和肝脏毒性.当PAs具有大环双酯结构和烯丙醇酯结构时，毒性较大，而AH不具有这样的结构，预计其毒性较小，确切情况尚须研究证实.

【参考文献】

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