酵母细胞的固定化-万晓涛

专题4酶的研究及应用课题3酵母细胞的固定化一、教学目标（一）知识与技能1、识记固定化技术的常用方法2、理解固定化酵母细胞的制备过程3、知道固定化酶的实例（二）过程与方法1、固定化细胞技术2、制备固定化酵母细胞的过程（三）情感、态度与价值观通过固定化技术的发展过程，培养科学探究精神，同时领会研究的科学方法二、课题重点与难点1．课题重点：制备固定化酵母细胞。2．课题难点：制备固定化酵母细胞。三、课题背景分析课题背景简单介绍了从酶到固定化酶、再到固定化细胞的发展过程。这一过程体现了科学技术的发展是不断地提出问题和解决问题的动态过程。在教学中，可以参考课题背景提供的素材，联系生产实践和学生已有的认识，引导学生认同上述观点，并进而认识到：科学知识既来源于科学实验，也来源于生产生活实践，知识的学习应该与生产实践相联系；人们在生产实践中所发现的问题能够促进科学技术的发展。在生物技术实践活动中，经常涉及技术原理和实践意义等内容，实验教学中要重视这些认知成分。自1969年世界上首次成功地将氨基酰化酶固定化用于拆分氨基酶以来，固定化酶和固定化细胞技术得到迅猛地发展，已广泛应用于氨基酸的拆分和提纯、葡萄糖和果糖的生产、诊断和分析试剂的制造、消除环境污染、特定的化学反应等等。教学中，不仅应遵循人类对固定化技术的研究历程来逐步引导学生理解固定化技术的意义，而且要重视用典型实例（高果糖浆的生产）的剖析来引导学生认识固定化技术的应用价值。以下为人类对固定化技术的认识历程。四、基础知识分析与教学【导学诱思】1•高果糖浆的生产需要使用 ，它能将葡萄糖转化成果糖。这种酶的 好，可以持续发挥作用。但是，酶溶解于葡萄糖溶液后，就无法从糖浆中回收，造成很大的浪费。使用固定化酶技术，将这种酶固定在一种 上,再将这些酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的 。酶颗粒无法通过筛板的小孔，而反应溶液却可以自由出入。生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与 接触，转化成果糖，从反应柱的下端流出。反应柱能连续使用半年,大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。固定化酶和固定化细胞是利用 或 方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术，包括 、 和 法。一般来说，酶更适合采用 和 法固定，而细胞多采用 法固定化。这是因为细胞个大，而酶分子很小；个大的难以被 或 ，而个小的酶容易从 中漏出。包埋法法固定化细胞即将微生物细胞包埋在不溶于水的中。常用的载体有 、 、 、 和 等。

(一)教学方法：启发式教学(二)教学工具：多媒体课件(三)教学过程：引入新课在应用酶的过程中，人们发现了一些实际问题：酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，提高了生产成本，也可能影响产品质量1、进行新课1.1固定化酶的应用实例一一生产高果糖浆学习内容：1.利用固定化酶技术生产高果糖浆的实例；2.固定化酶的反应柱示意图；3.固定化酶在生产实践中的优点要点1从酶到固定化酶、再到固定化细胞的发展过程 厂优点：催化效率高，低耗能、低污染，大规模地应用于食品、化工等各个领域。酶一 I—实际问题：对环境条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本；反应后酶会混合在产物中，如不除去，会影响产品质量。 设想：将酶固定在不溶于水的载体上。 优点：酶既能与反应物接触，又容易与产物分离，同时，固定在载体上的固定化酶一酶还可以反复利用。1—实际问题：一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成都是通过一系列的酶促反应才能得到的。 ►设想：酶是由细胞合成的，能否将合成酶的细胞直接固定。固定化细胞一优点：成本低，操作更容易。要点2固定化酶的应用实例高果糖浆的生产原理：葡萄糖~I葡萄糖异构酶_m 果糖葡萄糖异构酶固定：将葡萄糖异构酶固定在颗粒状载体上，装入反应柱中。高果糖浆的生产操作(识图4－5反应柱)：高果糖浆的生产需要使用葡萄糖异构酶，它能将葡萄糖转化成果糖。使用固定化酶技术，将这种酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这些酶颗粒装到一个反应柱内。柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应溶液却可以自由出入。生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液渡过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触，转化成果糖，从反应柱的下端流出。优点：反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。固定化酶的反应柱示意图固定化酶在生产实践中的优点酶既能与反应物接触，又容易与产物分离，提高产品质量；同时，固定在载体上的酶还可以反复利用，节约成本。1.2.固定化技术的方法(识图4－6固定方法)：在本课题中，我们将动手制备固定化酵母细胞，体会固定化酶的作用。常用的固定化技术：包埋法、吸附法和结合法，教学时先让学生讨论哪些方法适于酶固定化？哪些方法适于细胞的固定化？将酶和细胞固定化方法有包埋法、化学结合法和物理吸附法。在讨论的基础上加以总结如下：常用方法操作缺陷酶包埋法酶分子一般相对较小，容易从大分子有机物网格中逸出；如果反应物分子较大，则不易进入网格中与酶接触吸附法将酶吸附在不溶于水的载体上比较困难，同时酶也容易从载体上脱落结合法需要改变酶的某些结构（基团），酶的催化作用受到一定程度的影响细胞包埋法处于中心的细胞容易缺氧而受到损害，同时，反应原料不易进入到这些细胞之中比较】酶和细胞的固定方法和特点固定对象酶细胞适宜固定法化学结合法、物理吸附法包埋法特 点体积小，固定一种酶。包埋法容易丢失体积大，固定一系列酶。难以化学结合和吸附〖思考1〗对固定酶的作用影响较小的固定方法是什么？吸附法。〖思考2〗将谷氨酸棒状杆菌生产谷氨酸的发酵过程变为连续的酶反应，应当固定（酶、细胞）；若将蛋白质变成氨基酸，应当固定（酶、细胞）。（二）固定化细胞技术学习内容：1.将酶或细胞固定化的方法；2.固定化酶和固定化细胞的联系与区别；3.固定化酶和固定化细胞常用的载体材料。教学：固定化酶和固定化细胞通常采用包埋法、化学结合法和物理吸附法。在教学过程中，可以通过提问的方式，引导学生认识这三种方法的特点与适用范围。此外，还可以引导学生思考课本中提出的问题，引导学生理解固定化细胞和固定化酶这两种技术的区别与联系，辩证地认识这两种技术的优势与不足。例如，固定化细胞操作容易、对酶活性的影响更小、可以催化一系列的反应、容易回收等，但由于大分子物质难以自由通过细胞膜，因此固定化细胞的应用也受到限制。要点3固定化细胞技术（1）将酶或细胞固定化的方法固定化酶和固定化细胞是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。酶或细胞固定化的方法包括包埋法、化学结合法（将酶分子或细胞相互结合，或将其结合到载体上）和物理吸附法。酶适合采用化学结合和物理吸附法固定化，而细胞多采用包埋法固定化。这是因为细胞个大，而酶分子很小；个大的细胞难以被吸附或结合，而个小的酶容易从包埋材料中漏出。酶的几种固定方式将酶包埋在细微网格里；将酶相互连接起来；将酶吸附在载体表面。包埋法固定化细胞将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中。（2） 固定化酶和固定化细胞的联系与区别联系：都是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。在生产中都容易与产物分离，固定在载体上的酶或细胞可以反复利用。区别：适宜的固定方法不同；固定化细胞技术更适宜于生产实际。（3） 固定化细胞常用的载体材料常用的载体材料有明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。1.3．固定细胞的材料：固定细胞时应当选用不溶于水的多孔性载体材料，如明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等教学：课程标准中要求学生尝试制备和应用固定化酶，但考虑到制作固定化酶的技术要求比较高，中学生难以掌握，因此只要求学生制作技术难度较低的固定化酵母细胞，对于固定化酶的作用、原理及其在生产中的应用，主要是让学生通过生产实例来了解。在教学时可以采用让学生阅读自学的方式，并在阅读之前，布置一些思考题让学生思考。例如，在葡萄糖的异构反应中，如果不将葡萄糖异构酶固定化，而是直接使用葡萄糖异构酶，会对生产过程产生哪些影响？2．实验设计2.1．制备固定化酵母细胞酵母细胞的活化：1g干酵母+10mL蒸馏水f50mL烧杯f搅拌均匀f放置lh,使之活化。加蒸馏水搅拌干酵母 活化酵母〖思考3〗活化是指让处于休眠状态的微生物重新恢复正常生活状态的过程。配制CaCl2溶液：配制物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液0.83gCaCl2+150mL蒸馏水f200mL烧杯f溶解备用。配制海藻酸钠溶液：③配制海藻酸钠溶液称取0.7g海藻酸+10mL水f50mL烧杯f酒精灯微火(或间断)加热，并不断搅拌，使之溶化f蒸馏水定容到10mL。〖思考4〗微火加热并不断搅拌的目的是什么？防止海藻酸南焦糊。海藻酸钠溶液与酵母细胞的混合：将海藻酸钠溶液冷却至室温f加入活化酵母细胞f充分搅拌f转移至注射器中。〖思考5〗为什么要海藻酸钠溶液冷却后才能加入酵母细胞？防止高温杀死酵母细胞。固定化酵母细胞：以恒定的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2溶液中，液滴在CaCl2溶液中形成凝胶珠，凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30min。2.2．固定化酵母细胞的发酵冲洗：将固定的酵母细胞凝胶珠用蒸馏水冲洗2〜3次。发酵：150mL10%葡萄糖+固定化酵母细胞f200mL锤形瓶f密封f25°C发酵24h。〖思考6〗发酵过程中锥形瓶为什么要密封？酵母菌的酒精发酵需要缺氧条件。〖思考7〗锥形瓶中的气泡和酒精是怎样形成的？酵母菌进行无氧呼吸产生的。〖思考8〗在利用固定化酶或固定化细胞进行生产的过程中，需要无菌操作码？而令O2.3操作的注意事项本实验是一个定量实验，海藻酸钠溶液的浓度和酵母细胞溶液混合后的溶液浓度是决定实验成败的关键因素，这有赖于实验操作的各个环节严格按照要求进行。在具体的操作过程中，还应该注意下列问题。

.酵母细胞的活化。在缺水的状态下，微生物会处于休眠状态。活化就是让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态。酵母细胞所需要的活化时间较短，一般需要0.5〜1h,需要提前做好准备。此外，酵母细胞活化时体积会变大，因此活化前应该选择体积足够大的容器，以避免酵母细胞的活化液溢出容器外。加热使海藻酸钠溶化是操作中最重要的一环，涉及到实验的成败，一定要提醒学生按照教材的提示进行操作。海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量。如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少，影响实验效果因为Ca2+与Na+交换需要一定时间，刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。只有形成稳定的凝胶珠，才能在后续反应中进行利用。如何检验凝胶珠的质量是否合格？方法一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。方法二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。教学时结合下图分析可能存在的操作误差。从下图看，成功的凝胶珠如珍珠状，色白而圆润，而那些不规则的凝胶珠在CaCl溶液的位置通常是飘浮在溶液的上面或中间，这主要2是混合溶液的浓度过小或混入空气而造成的。表为实验步骤中的一些注意事项，可结合上图进行分析。实验步骤注意事项酵母细胞的活化活化时应用大一点的小烧杯，避免细胞溶液逸出，活化时间不易过长,20°C时只需1小时即可，该步骤由教师在课前完成配制CaCl溶液可实验前配制好，放入冰箱中储存2配制海藻酸钠溶液小火间断加热，并不断搅拌，直到完全融化，最后一定要定容海藻酸钠溶液与酵母细胞混合待海藻酸钠溶液冷却至室温时再混合，要充分搅拌并避免出现气泡。转移至注射器时，也要注意不要产生气泡固定化酵母细胞注射器与CaCl溶液的距离应保持在1米左右，混合溶液滴入烧杯时应保2持匀速3．发酵操作4.课堂总结、点评五、实验安排本课题可以安排2课时。第1课时完成课题背景和基础知识的学习，准备好基本的实验仪器，同时还可以组织学生提前配制好CaCl2溶液和用于发酵的葡萄糖溶液。第2课时进行酵母细胞的固定化操作。六、课题成果评价（一）观察凝胶珠的颜色和形状如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。（二）观察发酵的葡萄糖溶液利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒味。不仅要对学生制作的固定化酵母细胞进行评价，还要对学生的操作过程进行评价。此外，对酵母细胞固定化原理和实验操作方法的理解，也应是评价的有机组成部分。★课余作业1．什么是细胞的活化。2．如何检验凝胶珠的质量是否合格。★资料袋固定化细胞的载体固定化细胞技术所采用载体的物理化学性质直接影响所固定细胞的生物活性和体系传质性能。理想的载体材料应具有对微生物无毒性、传质性能好、性质稳定。寿命长、价格低廉等特性。它可分为有机高分子载体、无机载体和复合载体三大类。有机高分子载体又分为天然高分子凝胶载体和合成有机高分子凝胶载体。天然高分子凝胶一般对生物无毒，传质