开题报告 肝酶分离与提取

开题报告

肝酶的分离与纯化目的1.从生物样品中分离纯化生物大分子的技术路线和实施方案2.从动物肝组织中分离提取纯化和鉴定一种酶（三种不同亚基，结合酶，pI=6.2）的技术路线，实验步骤原理生物大分子定义生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子，结构具有一定的规律性，大多是由基本结构单位按一定顺序和方式连接而形成的多聚体。常见的生物大分子包括蛋白质(包括酶)、核酸、多聚糖等。实际上生物大分子的特点在于其表现出的各种生物活性和在生物新陈代谢中的作用。前期准备分离生物大分子的一般步骤材料的预处理——组织细胞破碎材料的粗提取生物大分子的精细分离性质具体方法分子大小和形态差速离心、凝胶过滤法、超滤法、分子筛、透析溶解度盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀等电荷差异电泳、离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤法生物功能专一性亲和层析生物大分子含量的测定和纯化鉴定测定多糖总量——菲林试剂法，蒽酮法，旋光法等。测定蛋白质和酶总量——凯氏定氮法，Folin-酚法，双缩脲法，紫外吸收法等。测定核酸总量——定磷法、紫外吸收法。二苯胺法测DNA，地衣酚法测RNA。实验思路材料预处理——饥饿处理肝脏酶的初步分离——等电点沉淀酶的精细分离——因只知道该酶的等电点，采用离子交换柱层析鉴定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1.材料的选择因动物肝脏中的酶往往结合较多的脂质、核酸等物质，所以取饥饿24小时的动物肝脏为实验材料1.材料处理1.材料处理酶体过氧化物酶体糖酵解酶体乙醛酸循环体超速离心分离技术的原理：细胞内不同结构的比重、大小和形态都不相同，在同一离心场中沉降速度不同。可根据这一原理，用差速离心法和密度梯度离心法将亚细胞组分分离。材料处理步骤1.取动物肝组织选取新鲜的，饥饿24小时的动物的肝脏，生理盐水冲洗2.对肝组织进行预处理（梯度离心获得含有酶的细胞液）在冰块中用小剪剪碎肝脏，移入插在冰块中洗净的匀浆器中进行匀浆分次加入0.25mol/L冰冷蔗糖10ml，匀浆液经32层纱布（或双层尼龙织物）过滤，得匀浆液离心管中加入5ml0.34M蔗糖，将5ml匀浆轻轻覆在其上，1600r/min离心10min，得上清液（1）沉淀加10ml0.25M蔗糖混匀，3500r/min离心10min，得上清液（2）沉淀加0.5ml0.25M蔗糖混匀，悬浮在9.5ml0.88

M蔗糖液上，3500r/min离心15min，所得沉淀为细胞核将上清液（1）（2）混合取1ml,6600r/min离心10min，得上清液，即为酶体和微粒体沉淀加0.25M蔗糖到1ml混匀，6600r/min离心10分钟，所得沉淀为线粒体由于蛋白质位置未知，所以需分别研究三者，即做三组平行试验加入蛋白酶抑制剂，沉淀法除去核酸。2.酶的粗提取等电点沉淀利用蛋白质可两性解离的性质，两性电解质在等电点时溶解度最低，通过调节溶液的pH值，使酶以沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。在溶液的pH值等于溶液中某两性电解质的等电点时，该两性电解质分子的净电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分子能聚集在一起而沉淀下来。因此可以通过调节介质的pH，把目的酶和杂蛋白分开。但由于蛋白质在pI点附近一定范围的pH内都可发生沉淀，只是沉淀的程度很不一样，而且相当多的蛋白质的pI点很靠近，所以该法的回收率和纯化倍数都不理想，一般只用于酶的粗分离阶段。透析用盐析法分离而得的蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步纯化，因此必须去除。透析法利用蛋白质和盐离子分子大小不同，盐离子小能透过透析袋而蛋白质分子不能，由此可除去盐离子步骤1）配制高浓度的硫酸铵溶液，测溶液PH