艾片中龙脑含量测定及组织分布研究

艾片中龙脑含量测定及组织分布研究

爱斯隆是科维生植物的艾纳香b.d.的新鲜叶片经过提取、加工和生产而成的结晶。它香气浓郁，味道辛辣味道。它具有开孔、醒神、清热、止痛的作用。艾片在临床上的应用极为广泛,特别是在心脑血管疾病的应用中尤引人关注,其极易透过血脑屏障,发挥开窍和“引药入脑”作用。鼻腔给药因其吸收迅速起效快、脑靶向性以及可以绕过体循环和血脑屏障等诸多优势已成为研究的热点。本文以艾片中的主要成分龙脑为指标,测定艾片经静脉和鼻腔给药后在小鼠体内不同时间点上的脑、心、肝、脾、肺、肾多个脏器中的分布经时变化,旨在揭示小鼠给予艾片后其在组织的分布规律,探讨鼻腔给药的脑靶向性,为临床应用的安全有效提供依据。1仪器、试剂和仪器气相色谱仪GC7980(ALS7020进样器;D7980色谱工作站;上海天美科学仪器有限公司);MET-TLERAE240型电子分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司);SartoriusBT25S型电子分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司);SartoriusBS110S型电子分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司);MP5002电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司);VDRTEX-5旋涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司);AnkeTGL-16G高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。龙脑对照品(中国食品药品检定研究院,批号110881-200706);十八烷(色谱纯,天津市光复精细化工研究所);乙酸乙酯(色谱纯,FisherScientific);艾片(贵州金色制药有限责任公司)。ICR小鼠,雄性,体重(20±2)g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供(动物批号0256504)。2方法2.1艾片滴鼻液的制备配制复合溶媒[1%聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(吐温-80)生理盐水-乙醇-丙二醇40∶30∶30],艾片研磨成细粉后,加入上述复合溶媒中,超声10min使之全部溶解,艾片质量浓度为150g·L-1,作为艾片滴鼻液。精密吸取滴鼻液1.0mL,置50mL量瓶中,以1%吐温80生理盐水溶液分散并稀释至刻度,混匀,即得含艾片3.0g·L-1的注射液。2.2单次给药,小鼠脱腰椎引导药取90只小鼠,给药前禁食12h,自由饮水。鼻腔给药前先用乙醚麻醉小鼠,固定其头部,按30.0mg·kg-1鼻腔给予滴鼻液4μL;或者尾静脉注射艾片注射液0.2mL。给药后在1,3,5,10,20,30,60,90,120min(每个时间点5只小鼠),将小鼠脱颈椎处死,迅速摘取脑、心、肝、脾、肺、肾组织。剥离筋膜、血管,以生理盐水冲洗,用滤纸吸干,称重。2.3乙酸乙酯法小鼠各组织以组织-生理盐水1∶1.5的比例匀浆。吸取小鼠组织匀浆液100μL置1.5mL离心管中,加入10μL质量浓度为46.6mg·L-1的十八烷乙酸乙酯溶液,涡旋60s,再加入90μL乙酸乙酯,涡旋60s,1万r·min-1离心10min,吸取上清液,进样1μL。2.4检测温度和载气流量TM-1701高效毛细管色谱柱(0.32mm×30m,0.25μm);柱温90℃保持8min,再以50℃·min-1升至170℃,保持6min;检测器氢火焰离子检测器;检测器温度300℃;进样口温度250℃;载气氮气;载气流量28mL·min-1;进样量1μL。3结果3.1分析的证实3.1.1内标十八烷保留时间按2.3项下方法进行处理后测定。在上述色谱条件下,龙脑的保留时间为7.30min,内标十八烷的保留时间为13.60min。空白组织匀浆以乙酸乙酯提取、空白组织匀浆中加对照品以乙酸乙酯提取以及给药后小鼠组织匀浆加内标以乙酸乙酯提取的气相色谱图见图1。3.1.2小鼠组织中龙脑质量浓度的测定精密称定龙脑对照品适量,加乙酸乙酯稀释成一定浓度的龙脑对照品溶液。取上述对照品溶液加乙酸乙酯分别稀释成一系列龙脑对照品溶液。各取10μL加入空白组织匀浆液中,涡旋混合60s,按2.3项下方法处理,GC测定。以龙脑与十八烷峰面积比值Y对小鼠组织中龙脑质量浓度(μg·g-1)X进行线性回归,回归方程见表1。小鼠组织中龙脑线性关系良好,最低检测限为0.06μg·g-1。3.1.3方法的精密度分别取空白组织匀浆液100μL,加入龙脑对照品,配制成含低、中、高浓度龙脑的组织样品,按2.3项下方法处理,GC测定,在同一天内测定3次,连续测定3d,进行方法的精密度试验(n=3)。以同样方法制备低、中、高浓度龙脑的组织样品,GC测定,代入标准曲线计算样品浓度,与理论值比较计算该浓度样品的方法回收率。另分别取生理盐水100μL,加入龙脑对照品配制成含低、中、高浓度龙脑的生理盐水样品,按2.3项下方法处理,GC测定,计算该浓度样品的萃取回收率。低、中、高浓度的日内和日间精密度RSD均小于5%,仪器的精密度良好;方法回收率在90%~110%(n=3),萃取回收率85%~115%(n=3),符合药代动力学要求,见表2。3.1.4稳定性测定分别取空白组织匀浆液100μL,加入龙脑对照品,配制成含低、中、高浓度龙脑的组织样品,按2.3项下方法处理,分别在0,3,6h测定,代入标准曲线计算样品浓度,得到低、中、高浓度的RSD均小于5%。表明样品在12h内稳定。分别取空白组织匀浆液100μL,加入龙脑对照品,配制成含低、中、高浓度龙脑的组织样品,-20℃冷冻保存,每隔30d测定龙脑含量,连续测定3次,得到低、中、高浓度的RSD均小于10%,表明组织匀浆液在-20℃冷冻90d内稳定。3.2最佳给药方案的确定小鼠给药后,按2.3项下方法处理,GC测定。静脉和鼻腔给药后平均药物浓度经时曲线分别见图2,3。药物浓度经时数据用Kinetica药动学软件拟合,拟合方法选择非房室模型,小鼠各组织中龙脑AUC0-120min比较见图4。以静脉给药的AUC为参比,计算的鼻腔给药的相对靶向系数Re,Re=AUCin/AUCiv,以各自给药途径的AUC总和为参比,计算各组织的靶向效率Te,Te=AUC/∑AUC,见表3。由结果可知,小鼠静脉给予艾片后迅速在各个主要脏器分布,给药后1min均检测到了最大值,在120min时含量较少。鼻腔给药除了脑组织外,其他脏器在10min达到吸收峰,脑组织中出现了双峰现象。以AUC0-120min的大小作为艾片在组织中分布量的指标,由图4可知,小鼠静脉给药后组织中龙脑的含量高低顺序为心>脑>肾>肺>脾>肝;鼻腔给药的顺序为脑>心>肾>肺>脾>肝。鼻腔给药的相对靶向系数在54.11%~68.37%,在脑、心、肾的靶向效率较高。4鼻饲液中auc的分布在本实验中,小鼠静脉给予艾片后迅速分布到各组织器官,之后在组织器官迅速消除,随着时间的延长,药物在各组织器官中的浓度逐渐降低,在体内没有蓄积。鼻腔给药吸收分布较快,在给药1min即能在各个组织中检测出龙脑。比较AUC的大小可以发现,鼻腔给药和静脉给药的AUC大小顺序分布几乎一致,都是在心、脑、肾中分布较多,在肺、脾、肝中分布较少;而鼻腔给药的相对靶向系数均在50%~70%,相对脑靶向性最大,为68.37%,脑靶向效率也最大,为26.07%。鼻腔给药的脑药浓时曲线出现双峰现象,推测其原因为,鼻腔给药后,大量艾片透过鼻黏膜经嗅黏膜通路迅速地进入脑组织,形成第1个峰,同时还有一部分艾片会透过鼻黏膜进入血液循环系统,由于冰片为小分子的脂溶性成分,极易透过血脑屏障进入脑组织,随着时间的