药用植物冬虫夏草、异龙脑和配伍的研究

药用植物冬虫夏草、异龙脑和配伍的研究

婆罗洲是传统的中医之一，已经使用了1500多年。《汉语手册》（2005年版）中记载了63种含有婆罗洲元叶的中药组合。目前《中国药典》收载有两种冰片,一为冰片(为区别计,下称“合成龙脑”),主成分为龙脑(消旋龙脑)和异龙脑的混合物,规定其中消旋龙脑的含量不低于55.0%;二为新收录的天然冰片(右旋龙脑),主成分为结构确定的右旋龙脑,纯度不低于95.0%。虽然中医传统使用梅片等天然冰片,但由于天然冰片的来源以前依靠进口,所以建国后中药复方中使用的冰片主要为合成龙脑。近年来有研究表明合成龙脑的质量不稳定,主要成分可随贮藏时间延长而发生变化。魏刚等对部分市售合成龙脑的质量进行了分析,发现某些药店出售的合成龙脑中樟脑(有毒性)含量可达45%以上,有的甚至达97%,而且随着时间延长,合成龙脑中龙脑和异龙脑含量逐渐降低,樟脑含量升高,表明龙脑和异龙脑在储存状态下有转化成樟脑的趋势,而且时间越长,转化成樟脑的比率越高。因此,在进行合成龙脑在动物体内的成分测定时,经常有樟脑成分被检出,这应与合成龙脑原料中含有一定量的樟脑有关。虽然樟脑作为中药应用在我国也有上千年的历史,但中医很早就认识到樟脑有毒和冰片无毒的差异。因此改变含冰片复方的这种尴尬局面的途径之一是采用天然冰片代替合成龙脑入药,而我国新开辟的天然冰片资源为改变这种局面提供了可能。《中国药典》自2005年版起开始收录天然冰片,该药材是用我国江西、湖南等地发现的樟科植物樟(Cinnamomumcamphora(L.)Presl)的新鲜枝、叶经提取加工制成的结晶。张伯礼等对天然冰片的安全性和药理作用做了对比研究,认为天然冰片无诱发小鼠骨髓嗜多染红细胞微核形成率增加的作用,对骨髓也无抑制作用,其安全性可以得到保证,在一定程度上可以代替合成龙脑入药。然而,本课题组在用GC-MS法进行小鼠体内冰片药动学研究时,无论是给小鼠灌服天然冰片还是合成冰片,在其血液、肝脏等组织样品中均检测到了樟脑的色谱峰。在冰片原料药中没有检测到樟脑存在的情况下,在小鼠体内检测到了樟脑成分其来源值得思考。为了探索冰片是否可在动物体内转化(或代谢)为樟脑,本研究进行了天然冰片、合成龙脑和异龙脑在动物(小鼠、大鼠和家兔)体内的GC-MS定性分析。一、材料表面1.药品、化学品天然冰片(纯度>98.0%,江西省吉林市林科天然冰片厂,批号:2060800);合成龙脑和异龙脑(纯度均>98.0%,广州市黄埔化工厂提供);冰片对照品(分析纯,中国药品生物制品检定所,批号:110743-200504);萘(分析纯,中国药品生物制品检验所,111673-200401)。正己烷(HPLC级,SKChemicals,韩国);乙醇(特级纯,江苏汉邦科技有限公司);CMC-Na(分析纯,天津市北方化玻购销中心);NaCl(分析纯,天津市北方化玻购销中心);PEG-400(分析纯,广州化学试剂厂);粟米油(食用级);石蜡油(分析纯,天津市沽工商实业公司);0.9%生理盐水。2.ankimdl-40b匀浆器(ULTRA-TURRAXT8,德国);台式离心机(AnkeTDL-40B,上海安亨科学仪器厂);振荡器(HY-4调速多用振荡器,江苏省金坛市医疗仪器厂);超声仪(SB25-12DTD,宁波新芝生物科技股份有限公司)3.动物及家兔不同性别的动物洁净级昆明种小鼠,体重20±2g,雌雄各半;洁净级SD大鼠,雄性,体重约200g;新西兰家兔,雄性,体重约1kg。以上实验动物均由中山大学实验动物中心提供。各种实验动物给药前24h禁食不禁水。4.离子源温度FinniganDSQTrace气相色谱-质谱(GC-MS)联用仪(美国热电公司);Xcalibular数据工作站。色谱柱为DB-5MS毛细管色谱柱(0.25mm×30m,膜厚0.25μm,美国安捷伦公司);温度采用程序升温方式,柱初温80℃,保持1min,然后以30℃/min升温至145℃,保持1min;载气为高纯氦气(99.999%),流速1mL/min;进样量为0.5μL,分流比为10:1;进样口温度为200℃;EI离子源,电子能量为70eV,离子源温度250℃;检测方式有两种,全扫描方式(m/z扫描范围50～650)和选择离子监测(SIM方式,樟脑、龙脑与异龙脑均为m/z95,萘为m/z128)。5.溶液制备(1)天然婆罗洲银币和合成龙脑溶液的制备称取天然冰片约50mg,用正己烷稀释至50mL,得到1mg/mL的天然冰片溶液;同法配制1mg/mL的合成龙脑溶液。(2)天然婆罗洲的四种混合溶液的制备分别称取约0.25g天然冰片,用0.8%CMC-Na,粟米油,石蜡油,PEG400各2.5mL混悬,得到天然冰片的四种混悬液。(3)内标萘的制备称取萘0.1022g,用正己烷溶解并稀释至50mL;精密吸取5mL,用正己烷稀释至50mL,得到0.24mg/mL的内标萘溶液。(4)异龙脑和悬浮液的合成称取合成龙脑、异龙脑各约0.3g,分别用3m10.8%CMC-Na混悬均匀即可。二、方法1.全血样的检测取肝脏样品约0.1g于10mL试管中,加入0.5mL生理盐水,匀浆,用0.5mL生理盐水冲洗匀浆头,洗液并入试管中;然后将组织匀浆超声5min;再加入100μL的0.24mg/mL内标萘溶液,混匀;加入1.5mL正己烷萃取,并于振荡器上中速振荡20min,以3500rpm离心5min;然后取上清液0.5μL,注入GC-MS仪进行全扫描分析或SIM分析。其它组织样品称重,按照同法处理。血浆样品定量吸取200μL,加入100μL的0.24mg/mL内标萘溶液,混匀,加入1.5mL正己烷,萃取离心过程同肝脏一样。以空白肝脏和血浆样品做对照。2.gc-ms分析将配制好的天然冰片和合成龙脑溶液直接注入气相色谱-质谱仪进行分析。用0.8%CMC-Na溶液混悬0.25g天然冰片,按照1.0g/kg的给药量给小鼠灌胃,并对以下制备的所有样品按“样品处理方法”继续处理后进行GC-MS分析:(1)空白血浆提取液。(2)全血加入天然冰片后离心,取血浆进行提取。(3)给小鼠灌胃天然冰片30min后的血浆进行提取。(4)空白肝脏样品。(5)空白肝脏取出后立即加入天然冰片溶液和内标溶液的样品。(6)空白肝脏匀浆后加入天然冰片,在37℃环境中放置30min后的样品。(7)取生理盐水,加入天然冰片后匀浆处理的样品。(8)天然冰片给小鼠灌胃30min后的肝脏样品。3.gc-ms分析取小鼠,称重,灌服1.0g/kg的配制好的天然冰片0.8%CMC-Na混悬液。30min后从小鼠眼球取血,抗凝离心取血浆;然后处死,取肝脏和心、脾、肺、肾、脑等组织样品,按“样品处理方法”处理后进行GC-MS分析。若需放置,则在-30℃冰箱保存。4.不同溶剂对小鼠血浆和肝脏组织gc-ms分析的影响,主要通过添加天然盘由于在不同文献中采用不同的溶剂溶解冰片,为了考察不同溶剂对冰片转化为樟脑的影响,以排除可能造成的干扰,我们将配制的几种不同溶剂(0.8%CMC-Na,粟米油、石蜡油和PEG400)的天然冰片混悬液分别给小鼠灌服,30min后取小鼠的血浆和肝脏样品,按“样品处理方法”处理后进行GC-MS分析。5.混悬液、异龙脑混悬液、异龙脑混悬液另取小鼠,分别灌服配制好的合成龙脑、异龙脑混悬液。30min后处死,取血浆和肝脏等组织样品,按“样品处理方法”处理后进行GC-MS分析。6.gc-ms分析取小鼠12只,称重后随机分为二组,每组6只,分别灌服1.0g/kg的天然冰片CMC-Na混悬液。每组分别在5min,15min,30min,45min,60min,90min时处死,取血浆和肝脏样品,按“样品处理方法”处理后进行GC-MS分析。取大鼠1只,称重,按照1.0g/kg体重灌服配制的天然冰片CMC-Na混悬液。在5min,15min,30min,60min眼眶静脉丛取血,每次约lmL,抗凝离心取血浆,按“样品处理方法”处理后进行GC-MS分析。取新西兰家兔1只,称重,按照1.1g/kg体重灌服配制的天然冰片CMC-Na混悬液。在5min,10min,15min,45min,60min,90min,120min时耳缘动脉插管取血,抗凝离心取血浆,按“样品处理方法”处理后进行GC-MS分析。三、结果1.分离和纯化了所有的组织在本实验设定条件下,GC-MS可以很好地分离樟脑、异龙脑、龙脑和内标萘的色谱峰,樟脑和萘都与其他主要成分达到基线分离,而且空白基质(血浆和肝脏等组织)对于各成分的分析无干扰。由于其他组织的分析结果与肝脏结果类似,以下结果主要以肝脏为例进行说明。图1表示GC-MS对空白肝脏和空白肝脏加冰片后各成分的全扫描分析结果。2.不同基质对樟脑分离的影响天然冰片、合成龙脑等冰片原料药的色谱图表明,给动物灌服所用的天然冰片和合成龙脑原料药中几乎检测不到樟脑。结果如图2所示。通过对冰片原料药与“原料药测定色谱图及天然冰片在小鼠血浆和肝脏处理过程中的转化研究”中(1)～(8)空白、对照等不同样品的对比分析,结果表明天然冰片在与各种基质混合后,没有检测到樟脑,其图谱与不加任何基质的分析结果基本一致,这表明在含天然冰片的血液和肝脏样品处理过程中没有产生樟脑;小鼠灌服冰片30min后血浆和肝脏中均检测到樟脑峰;而在(2)、(5)、(6)、(7)的处理结果中也未检测到樟脑峰,以上对比试验基本排除了天然冰片在样品后期处理过程中转化为樟脑的可能性。部分结果见图3。3.单独灌服天然冰酒的稳定性在给小鼠灌服冰片30min后的血浆和组织样品中,单独灌服天然冰片、合成龙脑或异龙脑的样品中均在同一保留时间检测到一色谱峰,该峰的保留时间和质谱碎片离子图与樟脑相应数据一致(见图3)。4.小鼠体内gc-ms分析取灌服天然冰片后小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑和血浆等组织,按“样品处理方法”处理后进行GC-MS分析,结果各组织样品中都检测到樟脑峰的存在。图4为小鼠灌服天然冰片30min后脑组织中的GC-MS图(SIM扫描方式)。由以上色谱图结果可以看出,小鼠脑组织中能够检测到较明显的樟脑峰。在小鼠的其它各组织的GC-MS分析色谱图中也明显检测到樟脑蜂的存在。5.灌服天然冰液对小鼠肝脏中gc-ms分析在用不同溶剂(CMC-Na,粟米油、石蜡油和PEG400)配制天然冰片混悬液给小鼠灌服后,在小鼠的肝脏样品中也均检测到樟脑峰。图5为灌服天然冰片不同混悬液后小鼠肝脏中的GC-MS图谱(全扫描方式)。结果表明,用不同溶剂制备天然冰片混悬液灌服小鼠后的样品中均检测到樟脑峰的存在;不同溶剂对天然冰片在体内转化成樟脑的情况没有实质区别。6.不同时间点的血浆中樟脑的相对含量(1)通过计算二批小鼠灌服天然冰片后不同时间点所取血浆和肝脏中樟脑与内标的峰面积比值,对樟脑相对含量的变化趋势作图分析(见图6)。结果表明,在小鼠血浆和肝脏中樟脑的含量都随时间延长而成一定规律变化。(2)给大鼠灌服天然冰片后,对不同时间点的血浆中樟脑相对含量变化趋势作图(见图7),表明樟脑的相对含量随着时间的变化而呈一定的变动。(3)给新西兰家兔灌服天然冰片后,对不同时间点的血浆中樟脑相对含量变化趋势做图(见图8)。结果表明,随着时间的变化,家兔血浆中樟脑含量逐渐增加,在所取的试验(时间)点内没有测得最高值。四、不同溶剂和混悬液对“人工”的解释1.冰片在中药复方中的应用非常普遍(如复方丹参滴丸等),一方面它本身具有开窍醒神和消炎止痛的作用,另一方面它还可以佐使其他药物透过血脑屏障而发挥作用,即“佐使则有功”的特点,王宁生等在此方面作了大量工作,其研究结果对于揭示冰片的作用特点和扩大使用范围很有帮助。随着《中国药典》(2005年版)收载了我国出产的天然冰片,这使得以前天然冰片来源稀缺的问题得到了解决,因此冰片(合成龙脑)有被天然冰片逐渐取代入药的趋势。近年来关于天然冰片研究的报道相对较少,仅有张伯礼等对其进行安全性和药效学方面的对比研究,认为与合成龙脑相比,天然冰片的安全性可以得到保证;但关于天然冰片的在生物体内的分析和药动学研究鲜见报道。本研究进行了天然冰片在动物体内的GC-MS分析,结果表明,天然冰片在动物(小鼠、大鼠和家兔)体内有转化(或代谢)为樟脑的可能。经对天然冰片原料药、空白对照,以及变换各种组合条件后的GC-MS分析,可以证实给小鼠灌服天然冰片后在体内可检测到樟脑,这提示冰片在体内有可能通过某种代谢机制转化为樟脑。由于樟脑具有一定毒性,特别对婴幼儿毒性更大,因此本研究结果在一定程度上可用来解释《中国药典》中对“冰片(合成龙脑)”中“注意:孕妇慎用”的禁忌内容,以及加拿大卫生部慎用“秘制保婴丹”通知的部分原因,本研究可以总结出如下结论:不是因冰片的结构与樟脑相似具有毒性,而是冰片可以在体内转化为樟脑,因而具有一定毒性。因此,本研究结果可对进一步考察天然冰片的安全性具有一定的参考价值。为此,本研究建议在《中国药典》的“天然冰片(右旋龙脑)”项目中增加与“冰片(合成龙脑)”同样的注意事项(即“注意:孕妇慎用”),以保证用药的安全。2.本研究对不同溶剂制成的天然冰片混悬液给小鼠灌服后的体内成分进行了GC-MS分析,结果表明,无论采用CMC-Na,还是