大鼠前列腺蛋白提纯液联合福氏完全佐剂致实验性慢性非细菌性前列腺炎大鼠模型的建立

大鼠前列腺蛋白提纯液联合福氏完全佐剂致实验性慢性非细菌性前列腺炎大鼠模型的建立

慢性非细菌前列腺炎（cap）是最常见的前列腺疾病。该病的就诊患者约占泌尿外科门诊总量的1/4。该病多发于20～40岁青壮年男性,病因尚不清楚,现在比较倾向于认为它是一种自身免疫性疾病。目前临床上仍然缺乏疗效确切、持续、适应范围广泛的治疗方法。没有一种合理的动物模型是阻碍新药物、新疗法研发进程的因素之一。因此,本研究从制作CAP大鼠模型入手,力图建立一种比较理想的CAP动物模型,并从形态学和分子生物学角度对CAP病因病机进行探讨。1材料和方法1.1动物、试剂和机器1.1.1动物3月龄Wistar种大鼠,雄性,体重180～220g,共48只,由辽宁中医学院实验动物中心提供。1.1.2检测试剂及检测福氏完全佐剂(FCA):将液体石蜡与羊毛脂按2:1比例共热至70℃混匀,高温灭菌后按5mg/ml加入佐剂用卡介苗(购于中国生物制品检验所),无菌乳化后使用;百白破疫苗:沈阳市皇姑区卫生防疫站提供;肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫测定试剂盒:由北京邦定泰克生物有限公司提供,批号:200211-15;诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)原位杂交检测试剂盒:购自武汉博士德生物工程有限公司;BcaBESTRNAPCRKitVer.1.1:购自宝生物(大连)生物技术有限公司,批号:RR023CA;3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH):由辽宁中医学院附属第一医院临床检验中心病毒实验室提供;DL-2000DNAMarker:购自宝生物(大连)生物技术有限公司;X174-HaeⅢDigestDNAMarker:购自宝生物(大连)生物技术有限公司;PCR引物:辽宁中医学院附属第一医院临床检验中心病毒实验室合成,序列如下:1.1.3仪器和检测方法分析天平(瑞士B6-EMETTLER);透射电镜(日本JEM-100CXⅡ型);酶标仪(美国Bio-RadBenchmark);电动玻璃匀浆机(宁波新芝科器研究所DY89-I);超声波细胞粉碎机(宁波新芝科器研究所JY92-II);蛋白核酸分析仪(美国贝克曼公司DU-600);PCR扩增仪(美国PE公司PE9600);洗板机(美国Bio-Rad1575);恒温箱(1815TC,SAEL-LAB);光学显微镜(日本OlympusCHK-213型);低温高速离心机(德国HeraeusBiofuge28s。)1.2实验方法1.2.1蛋白含量测定取240～300g雄性Wistar种大鼠10只,脱颈椎处死,在无菌条件下剥取前列腺组织,用冷生理盐水洗净,加入含0.5%TritonX-100的生理盐水溶液,在冰水浴上用玻璃匀浆器制成匀浆,10000×g离心,30min,取上清液,用721分光光度计,以牛血清白蛋白溶液为标准蛋白溶液,采用双缩脲法进行蛋白含量测定,最后用0.1mol/LpH7.2的PBS缓冲液稀释为5、10、15mg/ml浓度。1.2.2fca乳剂对大鼠胰腺蛋白表达的影响,临床组织化学成分检测48只大鼠随机分成正常对照组(n=12)、低剂量模型组(n=12)、中剂量模型组(n=12)及高剂量模型组(n=10)。除正常对照组外,其他各组均采用下述方法造模:大鼠乙醚麻醉,腹腔注射百白破疫苗0.5ml,多点皮内注射大鼠前列腺蛋白提纯液和FCA乳剂(比例为1∶1的混悬液)1.0ml,其中低剂量模型组大鼠前列腺蛋白提纯液浓度为5g/L,中剂量模型组浓度为10g/L,高剂量模型组浓度为15g/L。正常对照组分别行腹腔及皮内多点注射0.9%生理盐水注射液0.5、1.0ml。以上各组均分别于0、30d2次注射。1.2.3提交材料1.2.3.1血液采集正常对照组、高剂量模型组大鼠分别于首次注射后45d采用乙醚麻醉,颈动脉取血,送检ELISA法测定大鼠血清TNF-α含量。1.2.3.2.前组织取血后,同时断头处死其他各组大鼠,取前列腺组织送检。1.2.4测试项目1.2.4.1一般病理观察肉眼观察实验大鼠前列腺组织形态,测定前列腺湿重和前列腺湿重/体重比等。1.2.4.组织病理学观察将已用0.9%生理盐水漂洗干净的大鼠前列腺组织放入10%的中性甲醛溶液中固定,石蜡包埋切片,苏木精-伊红(HE)染色,光镜下观察实验大鼠前列腺组织中实质与间质的病理变化。1.2.4.透射电镜观察将大鼠前列腺组织切成1mm×1mm×1mm的组织块,投入2.5%戊二醛及1%锇酸中双重固定,乙醇、丙酮梯度脱水,Epon812环氧树脂包埋,LKB超薄切片机切片,醋酸铀、柠檬酸铝双重染色,透射电镜观察。1.2.4.吸光度值的计算测定大鼠血液样本反应后在波长490nm的吸光度值(A值)。所有A值减除空白值后进行计算。根据样品A值在该曲线上得出相应TNF-α的含量。1.2.4.介素-1、il-2mrna及il-2mrna的检测RT-PCR测定大鼠前列腺组织白介素-1β(IL-1β)、IL-2mRNA含量取50mg前列腺组织进行检测,观察、计算结果并照相。1.2.4.6ins原位异交检测标本常规处理后光镜下观察,记录并照相。iNOS原位杂交检测结果的阳性反应表现为出现棕红色点状颗粒。1.3统计学分析实验数据采用SPSS11.0统计软件包进行统计学分析;大鼠前列腺组织平均湿重、前列腺湿重/体重比等数据采用多组间方差分析检验;TNF-α值采用独立样本组间t检验。2结果2.1中剂量模型组与正常组湿重/体重比的比较高剂量模型组大鼠前列腺组织平均湿重、前列腺湿重/体重比与正常对照组相比均有明显增加,差异有显著性。中剂量模型组的前列腺湿重/体重比与正常对照组相比有差异,但其前列腺平均湿重与正常对照组比较,差异无显著性。低剂量模型组各项相关指标与正常对照组相比差异无显著性。见表1。2.2中剂量模型组与正常对照组主要病理反应及一定程度的慢性炎症反应正常对照组前列腺组织结构完整,无炎性细胞浸润或水肿;高剂量模型组大鼠的前列腺组织结构呈现明显异常:局部组织结构遭到不同程度的破坏,不均匀的组织增生或萎缩,导管扩张或损毁,部分基膜被破坏,分泌物增多或减少,以及慢性炎症表现(明显的慢性炎性细胞浸润,多为单核粒细胞、巨噬细胞及淋巴细胞),这些病理表现与正常对照组存在着明显差异(图1);中剂量模型组也出现了一些腺体结构异常及一定程度的慢性炎症表现,但远不如高剂量组明显。低剂量模型组与正常对照组的病理表现总体上相差不多。2.3各组细胞的组织病理表现正常对照组前列腺细胞胞质内可见线粒体小且数量较少,丰富的粗面内质网轻度扩张成池;高剂量模型组的前列腺细胞呈明显的高反应表现(明显的细胞核增大,异常丰富的粗面内质网重度扩张成池,部分胞质内出现髓样结构,可见部分线粒体扩张或呈空泡性改变;腺腔内可见大量粗大的金属样分泌颗粒),这些病理表现与正常对照组间存在着明显差异(图2)。中剂量模型组也出现了一些高反应腺体细胞的超微结构改变,如:粗面内质网中度扩张,部分线粒体胀大,但无空泡性改变,结构改变远不如高剂量组明显。低剂量模型组与正常对照组的超微结构表现则相差不多。2.4采用弹性法测定了大鼠血清tnf-f的含量本实验中高剂量模型组TNF-α值明显高于正常对照组,差异有显著性。见表2。2.5il-1的实验结果表明2.5.1il-1的rtpcr定性结果和分析高剂量模型组条带强度高于正常对照组,高剂量模型组的IL-1β基因表达水平高于正常对照组。见表3及图3。2.5.2il-1的rt-pcr半定量比较结果样品、内部高剂量模型组的半定量比值较正常对照组有所增高,高剂量模型组的IL-1β基因表达高于正常对照组。见表4及图3。2.6不同剂量模型组il-2基因表达水平对临床疗效的影响高剂量模型组与正常对照组条带相比,强度明显增强,高剂量模型组的IL-2基因表达明显高于正常对照组,决定IL-2活性的炎性基因表达异常。见表5及图4。2.7高剂量模型组大鼠炎性基因表达的比较中、低剂量模型组大鼠前列腺组织iNOS的表达强度与正常对照组相比虽有所增高,但程度明显低于高剂量模型组。高剂量模型组表现为胞质内棕红色颗粒较粗大,数量明显增多,弥漫分布于整个胞质内,其表达的强度明显高于正常对照组及中、低剂量模型组,高剂量模型组的iNOSmRNA含量明显增高,而且主要分布于胞浆内,该组大鼠的炎性基因表达明显异于正常的,这可能是该组大鼠出现其他形态学表现异常的分子生物学机制之一(图5)。3讨论3.1炎性基因与cap发病的关系造成CAP的病因至今仍未明确,目前认为最有可能导致CAP的病因是机体全身或局部原因所导致的免疫机能紊乱,这是目前CAP研究的热点,也为大多数学者所接受。其中,可以引发免疫性炎症反应的炎性基因与CAP发病关系的研究日益受到重视。许多人类疾病的发生和发展可归因于一些基因的异常表达,炎性基因即是其中之一。一旦这些基因的转录活性出现异常,机体的免疫应答、炎症反应及细胞的生长调控等方面都将发生改变,如果这种变化超出了机体可以调控的范围,就会对机体产生部位各异、程度不等的损伤。如果这种损伤发生在前列腺组织,就可能引发CAP。因此说TNF-α、IL-1β、IL-2、iNOS这些炎性基因的表达产物,连同NO,在机体的免疫调节以及CAP的发病过程中起着非常重要的作用。3.2动物模型诱导目前国内外关于慢性非细菌性前列腺炎动物模型的制备方法总体上分为两大类:第一类是动物前列腺局部直接注射化学制剂,造成化学性无菌性的前列腺炎症,如:角叉菜胶前列腺局部注射法、消痔灵前列腺局部注射法、甘油前列腺局部注射法、甲醛-巴豆油前列腺局部注射法、2%琼脂糖前列腺局部注射法等;另一类是采用生物制剂、动物前列腺匀浆或其加工制剂来刺激造模动物,产生免疫应答,在前列腺组织内产生免疫性炎症,如:同源性基因小鼠行前列腺匀浆辅以免疫佐剂皮下注射制备小鼠模型法、雌激素胶囊包埋诱导去睾丸大鼠法以及纯化大鼠前列腺蛋白提取物化学修饰成分结合免疫佐剂皮内注射制备大鼠模型法。其中第一类造模方法制作的动物模型,其发病机制是一种急性化学性炎症,炎性病理反应急促而剧烈,甚至出现前列腺组织的大范围坏死,这些表现不仅与CAP的临床表现不一致,病理表现具有很大差异,缺乏病理特异性,而且其发病机理也与目前对CAP研究所取得的基础和临床资料不一致,因而不是一种理想的CAP造模方法。因此,我们参照了第二类方法中Keetch与Maccioni等的造模与检测方法,采用了前列腺蛋白提纯液皮内注射结合双重免疫佐剂的方法进行造模,并在国内首次利用大体、光镜、电镜观察,ELISA、RT-PCR以及iNOS原位杂交等方法,摸索这种造模方法的有效给药剂量,而且进一步从形态学和分子生物学角度来探讨大鼠前列腺蛋白提纯液造成大鼠前列腺组织局部免疫性炎症所表现出的特点。3.3elisa法测大鼠胰腺组织tnf-和il-2、inos活性的表达本研究观察到,高剂量的大鼠前列腺蛋白提纯液可以使大鼠前列腺产生明显的大体病理学、组织病理学及电镜所示的超微结构改变,表现为:①高剂量模型组的前列腺组织平均湿重、前列腺湿重/体重比与正常对照组相比有明显增加;②高剂量模型组的前列腺组织呈明显的特异性炎性表现,存在着明显的组织缺损、破坏以及慢性炎症表现;③高剂量模型组前列腺细胞的超微结构呈明显的高反应表现,而且这些光镜与电镜病理表现与正常对照组间均存在着明显差异。而应用ELISA法测定大鼠血清TNF-α含量、半定量RT-PCR方法检测大鼠前列腺组织IL-1β、IL-2含量以及原位杂交方法检测前列腺组织iNOS活性的实验结果也显示出高剂量模型组的IL-1β、IL-2以及iNOS的基因表达明显高于正常对照组,这一结果表明决定IL-1β、IL-2、iNOS活性的炎性基因表达存在异常,这与Harris等的实验结果是吻合的。这些结果表明,该模型大鼠的前列腺组织出现了慢性炎症的病理变化,与CAP病理变化类似,同时其他学者的相关研究表明,这类造模方法仅引起前列腺组织局部的病理改变,而不会引起其他脏器的自身免疫反应,说明该方法还具有较好的特异性。本实验中高浓度的大鼠前列腺蛋白提纯液是造成CAP模型的有效剂量,而中、低剂量组未表现出明显改变,说明这两种剂量不足以明确地造成该动物模型。本研究中形态学上所表现的异常则提示以上提及的分子生物学表现的异常可能会导致前列腺组织局部偏离免疫稳态,呈现出免疫亢进的状态,而这种超出机体调控范围的免疫攻击可以对前列腺组织细胞造成炎症性损伤,这在临床上即可引发各种症状,导致CAP的发生。3.4tri能力的测定实验中应该注意:剥离前列腺组织时应尽可能把前列腺周围组织剔除干净,以利于抗原制备的纯化。在蛋白制备过程中应保持无菌操作。使用内皮细胞损伤