中和实验方法

RSV特异性中和抗体滴度检测一、 实验原理：抗体与相应的病毒粒子特异地结合，使后者失去对易感动物或细胞的致病力。（该试验方法以测定抗病毒血清的中和价，将待检血清2倍递增稀释，加等量已知毒价的病毒液。）二、 实验分类：固定血清--稀释病毒中和试验固定病毒一稀释血清中和试验简单定性中和试验空斑减少法三、 实验步骤：提前设定56°C水浴锅，将分装好的待测血清于56°C灭活（降低补体对实验结果的影响）30min。将加过双抗的培养基DMEM/F-12（用于Hep-2细胞；Vero细胞常用DMEM培养基）和BI血清进行37C预热30min，与此同时灭好实验台（该准备3599细胞培养板灭过菌枪头以及15ml和50ml摇菌管）为后续实验做准备。实验台灭菌30min，灭好台子后进行实验，首先取1.5mlEP管，用DMEM/F-12培养基8倍稀释待测血清（每管中加培养基210^1，再加相应的血清30见），拆开96孔培养板后在盖子进行设计（实验设计参考图1），最后向每孔中加入75^1的培养基，按照实验设计加入相应的稀释血清75^1，用排枪以两倍梯度稀释血清。（注意：最终到256倍时吸出的多余的75^1血清并弃掉。）实验孔以及阳性对照孔分别每孔加入25m（注意：加毒时应从血清低浓度到高浓度）的104TCID5O病毒混匀，4°C孵育2h。在实验剩余半小时左右进行消化细胞，镜检细胞汇合度为90%左右即可用，弃掉培养液后，用2-3ml无血清培养吹洗几遍细胞（意图为去除死细胞或活性不好的细胞），加入2ml胰酶后开始计时，将细胞培养板置于37^的CO2无菌培养箱培养消化2-3min，在镜检细胞间有间隙或细胞收缩为单个状态为好，加入等体积的无血清培养基终止，小心吸掉液体，加入有血清的培养基2-3ml轻轻地吹下皿底部的细胞，轻微用枪吹吸几次使其成为均匀的单细胞悬液后转移到新的15ml离心管中等待细胞计数。经过计数和相应的稀释后使得细胞浓度为105个/ml。最后加入104个Hep-2细胞（或1.5*104个Vreo细胞）100pl，将细胞铺好后于37C的CO2无菌培养箱培养。注意：使用细胞一般为5代以内，培养的细胞汇合度为90%左右即可用。培养72h后弃掉培养基，用PBST洗板3次，然后加入80%丙酮-PBS溶液（v/v）在4C冰箱固定15min，将孔内的液体弃掉，室温干燥。加入质量体积比为5%BSA（或5%脱脂奶粉）封闭，37C放置2h，弃掉废液后用PBST洗板3次，用力拍板数次使得孔内无水珠。使用2%BSA（或2%脱脂奶粉）将山羊抗RSV的多克隆抗血清稀释4000倍，加入每孔100pl后37C放置1h，PBST洗板5次，用力拍板数次使得孔内无水珠。使用2%BSA（或2%脱脂奶粉）将HRP（辣根过氧化物酶）标记的抗山羊IgG的多克隆抗血清稀释4000倍，加入每孔100pl后37C放置1h，PBST洗板6次，再次用力拍板数次使得孔内无水珠。每孔加入100plTMB显色液，于37C显色5min。每孔加入100pl的2moL/L的硫酸终止液，于OD450/620nm测定每孔的光密度值。中和抗体滴度的判断以低于阳性的50%光密度值为依据。试剂的配方：PBST的配方：0.05%Tween20溶于PBS（PH=7.4左右），TMB显色液配方：100见的TMB（10mg/ml）；4.4ml的磷酸氢二钠溶液（0.2M）5.6ml的柠檬酸溶液（0.1M，用1MNaOH调节至ljPH=5）1pl30%的过氧化氢溶液注意：实验中所用的细胞代数，和培养细胞的汇合度都得统一，感染复数MOI（平均每个细胞侵染病毒的个数）为1：1左右，TCID50含义：将该病毒稀释106.5接种100pl可使50%的细胞发生病变。PFU:（Plaqueformingunit）空斑形成单位，感染性滴度的单位一般为PFU/mloMOI:（Multiplicityofinfection）感染复数；传统的感念起源于噬菌体感染细菌的研究，含义为感染时噬菌体与细菌的数量比值，也