Bcl-x选择性剪接微基因报告方法的建立

Bcl-x选择性剪接微基因报告方法的建立黄波基金项目：国家自然科学基金（No.30700338）作者简介：黄波，男，1983年生，南昌大学2007级硕士研究生，Email：jxmuhb666@。通讯作者：王小中，男，副教授，研究方向为白血病分子诊断，Email：wangxzlj@126.com。，王小中1，王彩纹1，李静2基金项目：国家自然科学基金（No.30700338）作者简介：黄波，男，1983年生，南昌大学2007级硕士研究生，Email：jxmuhb666@。通讯作者：王小中，男，副教授，研究方向为白血病分子诊断，Email：wangxzlj@126.com。（南昌大学：1第二附属医院检验科，2第一附属医院检验科，江西南昌330006；3DepartmentofDermatology,TheFeinbergschoolofMedicine,NorthwesternUniversity,Chicago,IL60611,USA）【摘要】目的：构建凋亡相关基因bcl-x微基因（minigene）及针对其重要顺式作用元件B2G,CRCE2的突变微基因，建立bcl-x微基因报告法并应用于bcl-x选择性剪接机制的研究。方法：首先用PCR从K562细胞基因组DNA中扩增出Bcl-x基因外显子2及内含子2的5′端部分序列片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(-)中，然后扩增出Bcl-x基因内含子2的3′端及外显子3部分序列，定向插入上一片段下游，构建成pcDNA3.1(-)-bcl-x微基因。另外，以pcDNA3.1(-)-bcl-x微基因为模板，利用反向PCR法构建突变微基因pcDNA3.1(-)-bcl-x-B2G（M）,pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE2（M）。应用微基因及其突变微基因瞬时转染HL-60细胞，通过RT-PCR测定细胞中bcl-xL/bcl-xSmRNA水平的变化。结果：所克隆的bcl-x微基因及其突变微基因无一错误突变。在HL-60细胞中，bcl-x顺式作用元件B2G,CRCE2对bcl-xL/bcl-xS有一定影响。结论：成功构建人类凋亡相关基因Bcl-x的微基因及其突变微基因，顺式作用元件B2G缺失使bcl-xS几乎消失，CRCE2突变使bcl-xL/bcl-xS上升。【关键词】微基因报告;微基因;突变微基因;bcl-xL/bcl-xS;选择性剪接Establishmentoftheminigenemethodforreportingthealternativesplicingofbcl-x[Abstract]AIM：Toconstructthebcl-xminigeneanditsmutagenesisminigenestargetingitscis-elementscalledB2G、CRCE2,establishingtheminigenereportforfuturestudingthealternativesplicingofbcl-x.METHODS：AtFirst,amplifiedthefragment(P1P2)includingexon2andpartof5‘sequenceofintron2inbcl-xgenebyPCRfromhumanleukemiacellK562genomicDNA,Then,directionallyinsertedthefragmentintotheplasmidpcDNA3.1(-),wecalleditpcDNA3.1(-)-p1p2;andthesecond,weamplifiedthefragment(P3P4)including3’sequenceofintron2andpartofexon3inbcl-xgene,thendirectionallyinsertedthefragmentintothedownstreamoffragmentp1p2,wecalleditpcDNA3.1(-)-p1p2-p3p4,itispcDNA3.1(-)-bcl-xminigene.Ontheotherhand,weutilizedpcDNA3.1(-)-bcl-xminigeneastemplatetoconstructitsmutagenesisgenecalledpcDNA3.1(-)-bcl-x-B2G(M)、pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE2(M)byinversePCR.WeintroducedtheminigeneanditsmutagenesisminigenestothecellHL-60bytransientinfection,anddetectedthevariationofbcl-xL/bcl-xSinmRNAlevel.RESULTS：Thebcl-xminigeneanditsmutagenesisminigenethatweclonedabosolutlycorrect,havingnonefaultmutagenesis.InHL-60cell,thecis-elementsCRCE2、B2Gofbcl-xgenehadsomeeffectorsonbcl-xL/bcl-xS.CONCLUSION:Wesuccessfullyconstructedtheminigeneandmutagenesisgenesofhumanapoptotic-relatedgenebcl-x.DeletionofB2Gcouldalmostresultinthedispearanceofbcl-xS,andreplacementmutationofCRCE2couldincreasetheratioofbcl-xL/bcl-xS.[Keywords]minigenereport;minigene;mutagenesisminigene;bcl-xL/bcl-xS;cis-actingelement.引言细胞凋亡过程中常常会发现相关基因发生选择性剪接(alternativesplicing)，产生功能明显不同甚至相互拮抗的蛋白异构体[1]。凋亡调控基因bcl-x前mRNA通过选择性剪接主要产生两种mRNA，分别编码一长(Bcl-xL)一短(Bcl-xS)两种蛋白质，Bcl-xL具有抗凋亡作用，而Bcl-xS具有促凋亡作用[2]。bcl-x选择性剪接异常导致Bcl-xL/Bcl-xS比值的增高与肿瘤的发生密切相关。在肿瘤细胞中，蛋白异构体Bcl-xL常常是主要形式，并且它的过量表达可导致对化疗药物的抵抗[3]，而蛋白异构体Bcl-xS过量表达可增加对化疗药物的敏感性[4]，但Bcl-xL/Bcl-xS比值如何发生异常，目前没有确切的机制，有待进一步研究。本文通过建立bcl-x微基因报告法为进行bcl-x选择性剪接机制的研究打下基础。1材料和方法1.1材料①质粒和菌株：质粒pcDNA3.1(-)购自上海捷瑞生物工程有限公司,感受态细胞E.coliDH5ａ购自北京全式金生物技术有限公司；②主要试剂：2×TaqPCRMarsterMix、细胞基因组DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、总RNA提取试剂TRNZOL均购自天根生化（北京）科技有限公司；氨苄青霉素购自美国Amersco公司；限制性内切酶、T4DNA连接酶购自美国promega公司；KOD-Plus突变试剂盒购自东洋纺（上海）生物科技有限公司；Lipofectamine2000购自美国invitrogen公司；RT-PCR试剂盒购自Fermentas（加拿大）公司；③引物合成：所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。④图像分析软件:BIO-RAD公司的quantityone。1.2方法1.2.1目的基因的扩增根据bcl-x基因的DNA序列和符合包含有xS及xL剪接位点调控元件的要求分别设计P1、P2、P3、P4四对引物，P1:5’-AGATATCTAGAATGTCTCAGAGCAACCGGGAGCTG-3’;P2:5’-TAGATCTCGAGCAATCACCCAACACAACAGAAAGAG-3；P3:5’-ATAGCGAATTCCACAGTCATGCCCGTCAGGAACCAG-3’;P4:5’-TAGATCTCGAGCCACCCACCTACATCACTCTCTGAG-3’。其中斜体部分为酶切位点前加的保护碱基，划横线部分分别为XbaⅠ、XhoI、EcoRⅠ、XhoI酶切位点。用引物P1、P2扩增人K562细胞基因组bcl-x基因外显子2及内含子2的5′端部分序列，反应条件为：94℃5min；（94℃50s，59℃45s，72℃50s）×35循环；72℃7min。用引物P3，P4扩增bcl-x基因内含子2的3′端及部分外显子3序列，反应条件为：94℃5min；（94℃501.2.2bcl-x微基因的构建及鉴定用XbaI及XhoI酶切P1、P2扩增出的PCR产物，定向插入同样双酶切的真核表达质粒pcDNA3.1（-）相应的双粘端切口内，构建成pcDNA3.1（-）-p1p2，酶切鉴定后送上海捷瑞生物工程有限公司测序，鉴定无误后，再用XhoI及EcoRI酶切P3、P4扩增出的PCR产物，定向插入到同样双酶切的pcDNA3.1（-）-p1p2的质粒中，p3p4片段位于p1p2片段下游，构建成pcDNA3.1（-）-p1p2-p3p4，即pcDNA3.1（-）-bcl-x，双酶切鉴定后送上海捷瑞生物工程有限公司测序。微基因中bcl-x基因片段构建策略见图1。图1.微基因中bcl-x基因片段构建策略1.2.3微基因pcDNA3.1(-)-bcl-x及其突变微基因在HL-60中的表达及鉴定参照lipofectamine2000使用说明，用pcDNA3.1(-)-bcl-x微基因及其突变微基因pcDNA3.1(-)-bcl-x-B2G（M）,pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE2（M）瞬时转染HL-60细胞，转染48h后，进行总RNA提取，根据pcDNA3.1(-)-Bcl-x微基因的序列设计特异性引物P5：5’-AAACGGGCCCTCTAGAATGT-3’；P6：5’-GAATCACCAAACACAACAG-3’,使用RT-PCR方法鉴定bcl-x基因的表达情况。1.2.4突变微基因pcDNA3.1(-)-bcl-x-B2G(M）pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE2（M）的构建及鉴定按照KOD-PLUS突变试剂盒要求和参见Massiello等[5]、Garneau等[6]文章的构建突变序列设计引物如下：突变（CRCE2）1：5‘-GAATTCGCACGTTAGCGGGGCACTGTGCGTGGAAAGCGTA-3’、突变（CRCE2）2：5‘-CCACAATGCGACCCCAGTTTACCCCATCCCGGAAGAGTTCA-3’；缺失(B2G)1：5‘-CGCATTGTGGCCTTTTTCTCCTTCG-3’、缺失（B2G）2：5‘-ATTCACTACCTGTTCAAAGCTCTGA-3’。横线部分为EcoRⅠ酶切位点，包含在突变序列之内，方便于酶切鉴定构建是否成功。以鉴定无误的微基因pcDNA3.1（-）-bcl-x质粒为模板，进行反向PCR，按照试剂盒说明进行操作,最后将反应终产物转化E.coliDH5ａ，用含氨苄青霉素的平板筛选阳性菌落，将菌落增菌后提取质粒，酶切鉴定后送上海捷瑞生物工程有限公司测序。2结果：2.1目的基因的扩增、克隆及鉴定2.1.1以人白血病细胞K562基因组DNA为模板，P1和P2为引物，经PCR扩增得约686bp的目的片段；以P3和P4为引物扩增出约178bp的目的片段。如图2：212133178bp686bp500bp100bp250bp750bp2000bp1000bp178bp686bp500bp100bp250bp750bp2000bp1000bp图2.目的基因PCR扩增片段电泳图第1泳道：DL2000marker；第2泳道：P1、P2为引物PCR扩增出的目的片段；第3泳道：P3、P4为引物PCR扩增出的目的片段。2．1．2微基因pcDNA3.1（-）-bcl-x分别经XbaI和EcoRI双切、XbaI和XhoI双切鉴定均得到预期的片段（如图3），测序结果正确。1123112322670bp832bp250bp500bp100bp750bp1000bp2000bp670bp832bp250bp500bp100bp750bp1000bp2000bp图3.微基因pcDNA3.1（-）-bcl-x酶切鉴定电泳图第1泳道：DL2000marker；第2泳道：微基因pcDNA3.1（-）-bcl-x经XbaI和EcoRI双切后电泳图；第3泳道：微基因pcDNA3.1（-）-bcl-x经XbaI和XhoI双切后电泳图。2．1．3突变微基因pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE2(M)EcoRI单酶切和pcDNA3.1(-)-bcl-x-B2G（M）XbaⅠ、EcoRⅠ双酶切后均得到预期片段（如图4），测序结果正确。312312802bp401bp802bp401bp图4.突变微基因pcDNA3.1(-)-bcl-x-B2G(M）、pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE2（M）酶切鉴定电泳图第1泳道：100bpPLUSⅡDNALadder；第2泳道：pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE2（M）经EcoRI单酶切后电泳图；pcDNA3.1(-)-bcl-x-B2G（M）XbaⅠ、EcoRⅠ双酶切后电泳图2．1.4RT-PCR鉴定微基因pcDNA3.1（-）-bcl-x、pcDNA3.1(-)-bcl-x-B2G（M）、pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE2(M)在HL-60细胞中表达，用P5和P6引物扩增出目的条带Bcl-xL和Bcl-xS,如图5：470bp(bcl-xS)659bp(bcl-xL)423470bp(bcl-xS)659bp(bcl-xL)4231图5微基因及其突变微基因转染后RT-PCR电泳图第1泳道：100bpPLUSⅡDNALadder；第2泳道：pcDNA3.1（-）-bcl-x转染后RT-PCR电泳bcl-xL/bcl-xS为1.4；第3泳道：pcDNA3.1(-)-bcl-x-B2G（M）转染后RT-PCR电泳后bcl-xS几乎消失；第4泳道：pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE2(M)转染后RT-PCR电泳bcl-xL/bcl-xS为突变微基因pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE2(M)中突变部分测序图与pcDNA3.1（-）-bcl-x中对应部分测序图比较见图6:ab图6.pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE2(M)中突变序列与对应正常序列测序比较图（6a）CRCE2突变序列：GAATTCGCACGTTA；（6b）CRCE2正常序列：CCTTTTTCTCCTTCG。2.1.6突变微基因pcDNA3.1(-)-bcl-x-B2G（M）中缺失序列测序与pcDNA3.1（-）-bcl-x中对应部分测序图比较见图7：cd图7pcDNA3.1(-)-bcl-x-B2G(M)中缺失突变序列与对应正常序列测序比较图（7c）B2G前后部分序列：TGAATCGCAT；B2G序列：GAACTCTTCCGGGATGGGGTAAACTGGGGT。3讨论选择性剪接是指剪接可能发生在隐蔽的剪接位点，致使外显子遗漏（exonskipping）和（或）内含子保留（intronretention），是一个前mRNA通过选择不同的剪接位点组合产生不同mRNA剪接变异体的过程，进而表达多个可能具有不同生物学功能的蛋白质。据估计，含多个外显子的前mRNA97%可发生选择性剪接[7]。Bcl-x是Bcl-2家族成员之一，在细胞增殖、分化、凋亡过程中起着非常重要的作用，bcl-x通过选择性剪接可以产生几种mRNA异构体，特别是Bcl-xL和Bcl-xS,因为它们编码的蛋白在细胞凋亡过程中具有相反的作用，选择性剪接异常导致Bcl-xL/Bcl-xS比值升高与肿瘤发生密切相关，但其确切机制尚不完全清楚。选择性剪接受顺式作用元件和反式作用因子相互作用的调控，从这两方面展开选择性剪接的相关研究具有重要作用。微基因报告法是研究选择性剪接相关顺式作用元件的经典方法[8]，它是指将待研究的基因组片段插入真核表达载体启动子及终止序列之间而构建的重组载体，导入细胞后，根据其产物mRNA的长度变化，方便地判断细胞内是否有选择性剪接事件发生，是鉴定和在体（invivo）分析顺式作用元件的有力工具[9]。B2G是由富含G嘌呤的30个碱基组成的顺式元件，Garneau[6]等研究发现在Hela细胞中，hnRNPF/H蛋白通过结合该元件可增加bcl-xS5'剪接位点的利用，bcl-xS比例上升，而缺失B2G元件则几乎不产生bcl-xS；CRCE2(ceramide-responsivecis-element2)是神经酰胺反应性顺式作用元件2的简称，它是富含嘧啶碱基的序列，Massiello[5]等在研究神经酰胺对bcl-x选择性剪接的作用时鉴定出的具有重要作用的顺式作用元件，并证实该元件部分序列突变将使基因bcl-x选择性剪接的位点发生改变，使Bcl-xL/Bcl-xS比值降低。因此，B2G、CRCE2对细胞中bcl-x基因的选择性剪接研究具有重要意义。本研究通过RT-PCR法检测bcl-x微基因及顺式作用元件B2G、CRCE2的突变微基因瞬时转染HL-60细胞后,B2G缺失使bcl-xS下降，CRCE2突变时仅轻度上调bcl-xL/bcl-xS比值。近年来，bcl-x选择性剪接的调控受到关注，通过微基因报告法发现了一些相关顺式作用元件和反式作用因子。Revil等报告了位于bcl-xS剪接位点上游187个核苷酸的序列元件可依赖于蛋白激酶-C信号对Bcl-xS剪接位点的利用产生抑制作用[10]；RNA结合蛋白Sam68在酪氨酸激酶Fyn调控下，与hnRNPA1一起作用可促进bcl-xS生成[11]；最近，又有研究表明SR蛋白SC35的作用可增加bcl-xS的生成[12],RBM25作用于bcl-xS5'剪接位点上游序列元件可以增加该剪接位点的利用[13]。可见，位于bcl-x两个竞争性5'剪接位点间的序列有许多重要的剪接调控元件。另外，我国学者褚嘉祐等证实bcl-xL5'剪接位点下游的内含子区域参与细胞因子IL-6、GM-CSF对选择性剪接的调控[14]。本文正是通过包含这些重要序列的bcl-x微基因及针对重要顺式元件B2G、CRCE2的突变微基因的构建，建立bcl-x微基因报告法对深入研究bcl-x选择性剪接机制打下基础。[参考文献]1Schwerk,CandSchulze-Osthoff,k.Regulationofapoptosisbyalternativepre-mRNAsplicing[J].Molcell,2005,19:1-13.2Boise,LH,Gonzales-Garcia,M,etalbcl-xa50bcl-2-relatedgenethatfunctionsasadominantregulatorofapoptoticcelldeath[J].Cell,1993,3CastillaC,CongregadoB,Chinchon,D,etalBcl-xLisoverexpressedinhormone-resistantprostatecancerandpromotessurvivalofLNCaPcellsviainteractionwithproapoptoticBak.Endocrinology[J].2006,147:4960-4967.4HossiniAM,EberleJ,FeckerLF,etal.ConditionalexpressionofexogenousBcl-X(S)triggersapoptosisinhumanmelanomacellsinvitroanddelaysgrowthofmelanomaxenografts[J].FEBSLett.2003,553:250-256.5AutumnMassiello,ArelisSalas,RyanL,etal.IdentificationofTwoRNAcis-ElementsThatFunctiontoRegulatethe5_SpliceSiteSelectionofBcl-xPre-mRNAinResponsetoCeramide*[J].JBiolChem2004,279(16):15799-15804.6DanielGarneau,TimotheeRevil,Jean-FrancoisFisette,etal.HeterogeneousnuclearribonucleoproteinF/HproteinsmodulatethealternativesplicingoftheapoptoticmediatorBcl-x[J].JBiolChem.2005,280(24):22641-22650.7WangET,SandbergR,Luos,etal.Alternativeisoformregulationinhumantissuetranscriptomes[J].Nature.2008,456(7221):470-476.8ThomasA.Co