医学免疫学教学课件：流式细胞术的基本原理及应用

流式细胞术的基本原理及应用FCMPrinciplesFCMApplications

SpleenTcellsdetectionFlowCytometryPrinciplesFlowCytometryPrinciples流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM）是一种快速、准确、客观的检测直线流动状态中单个细胞多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术。检测速度快，分析样本量大在极短时间内可分析大量细胞，这是流式不同于其他细胞分析仪器的主要特点，可以每秒钟上万个细胞的速率进行测量。可检测的样本种类多样各种细胞（如外周血，骨髓，实体组织，悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球。流式工作原理

通过激光激发高速流动的单个细胞所携带的各种荧光素和荧光染料，并检测由此产生的散射光和荧光染料的发射光，通过各种光信号的强弱来反映细胞的各种特征。流式细胞仪工作原理示意图FlowCytometryPrinciples前向角散射光（FSC）当细胞颗粒通过聚集的激光束时，激光向各个方向散射。与激光束方向同轴的称前向角散射光信号（FSC）。FSC一般表征细胞相对大小及其表面积。

侧向角散射光（SSC）与激光束垂直的称为侧向角散射光信号（SSC）。SSC一般表征细胞粒度及细胞内相对复杂性。

散射光信号，散点图(DotPlot)某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射光波长长的光线-即荧光。而这些受激发后能产生荧光的物质称为荧光素。单参数荧光直方图双参数荧光散点图荧光补偿原理

荧光补偿（compensation）是指在流式细胞多色分析中，纠正荧光素发射光谱重叠（spectraloverlap）的过程，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号。荧光素光谱的重叠尽量减少。1973年BD公司推出世界第一台商品化的流式细胞仪FACSI流式细胞仪的组成液流系统光学系统电子系统FCMPrinciplesFCMApplications

SpleenTcellsdetectionFCMApplications细胞结构细胞大小细胞颗粒度细胞表面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量………细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内/外细胞因子激素结合位点、细胞受体蛋白磷酸化pH值钙离子浓度细胞膜电位、线粒体膜电位………FCMApplicationsFCMApplications细胞周期&倍体分析

碘化丙啶(Propidium，简称PI)是一种双链DNA的荧光染料。碘化丙啶和双链DNA结合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。细胞内的DNA被碘化丙啶染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，然后根据DNA含量的分布情况，可以进行细胞周期分析。FCMApplications细胞凋亡

细胞凋亡，又称为程序性细胞死亡(ProgrammedCellDeath)是机体主动的、高度有序地清除无用细胞的过程。和细胞坏死(Necrosis)相区别，坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。

磷脂酰丝氨酸(PS)的检测：早期凋亡

正常细胞（NormalCell）膜内----磷酯酰丝氨酸（PS）膜外----磷脂酰胆碱、鞘磷脂凋亡细胞（ApoptoticCell）膜内----磷酯酰丝氨酸（PS）膜外----磷脂酰胆碱、鞘磷脂、PSAnnexinV，PI双染法检测细胞凋亡

FCMApplications细胞增殖分析—CFSE标记法

荧光染料CFSE，是一种良好的细胞标记物。当细胞进行分裂增殖时，具有荧光的胞质蛋白被平均分配到第二代细胞中，这样与第一代细胞相比，其荧光强度便会减弱至一半；以此类推，分裂得到的第三代细胞的荧光强度便会比第二代细胞再次减弱。这种现象可以在488nm的激发光下，采用流式细胞仪检测分析，通过检测到细胞荧光强度不断的降低，进一步分析得出细胞分裂增殖的情况。FCMApplications免疫学研究FCMApplications根据功能，淋巴细胞主要分为：T淋巴细胞（CD3+），与细

胞免疫有关总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病；B淋巴细胞（CD19+）与体液免疫有关；NK细胞（CD3-CD16+CD56+），行使免疫监控功能，能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。FCMApplications调节性T细胞（Tregs）Tregs在抑制重要的病理性的免疫反应中，如：过敏反应、

自身免疫病、免疫-炎症状况等有重要影响。

•表面标志：CD4，CD25，CD127，FOXp3

FCMApplications干细胞研究北京时间10月8日，2012年诺贝尔生理学或医学奖揭晓，约翰·戈登（JohnB.Gurdon）和山中伸弥（ShinyaYamanaka）获奖，获奖理由为“发现成熟细胞可被重编程变为多能性”。

FCMApplications干细胞研究—FCM

FCM应用

—胞内

—胞外

—上清细胞培养

分化

寻找生物标记StemCells定性SidePopulation分析StemCells分离

FCMApplications毒理药理实验——微核分析正在复制的细胞由于出现染色体断裂或者纺锤装置功能异常而导致有丝分裂染色体分布紊乱，分裂后期这些染色体碎片或整条染色体遗留在细胞液中，即所谓微核(micronucleus，MN)传统的微核计数方法枯燥、耗时，而且易受操作者主观因素影响，流式细胞术计数是一种高通量、客观、灵敏和自动化的替代方法。微核具有边缘清晰和特异染色的特征，尤其适用于FCM技术进行自动化计数。FCMApplicationsFCMPrinciplesFCMApplications

SpleenTcellsdetection（Ficoll密度梯度离心法）Ficoll密度梯度离心法脾脏细胞混悬液中各种有形成分比重存在差异，利用比重为1.077、近于等渗的Ficoll-hypaque混合液（又称淋巴细胞分离液）做密度梯度离心时，各种成分将按密度梯度重新聚集。红细胞及其他细胞和死细胞碎片Ficoll分液层淋巴细胞层PBS覆盖层SpleenTcellsdetection实验步骤取小鼠脾脏组织块，置于装有PBS的平皿内；取200目不锈钢过滤网，用注射器内芯研磨脾脏，磨碎后加入少量PBS，吹打至混合均匀，转入15ml离心管，定容至10ml，1500rpm，离心5min，弃上清，用2mlPBS重悬细胞；SpleenTcellsdetection将2mL淋巴细胞分离液（室温）预先加入到流式管中，然后将细胞悬液缓慢加入到此流式管中（切记缓慢）；2200rpm，25℃，离心25min，注意，离心机一定要慢升慢降；用吸管吸取中间层的灰白细胞，放入另一只流式管中，加2mlPBS，1500rpm，离心5min，弃上清，加入10μL流式抗体，混匀，RT，避光染色15min；SpleenTcellsdetection分组：Unstaininggroup(NEG)CD3singlestaininggroup(CD3)CD4singlestaininggroup(CD4)CD3/4doublestaininggroup(双)加入500μLPBS，混匀，1500rpm离心5min，弃上清；重复步骤7；加入100μL1%PFA，4℃避光保存，待上机检测。SpleenTcellsdetection实验结果按以下时间段，进行分组检测14:00-14: