初情期苔藓原毛氏杆菌程序开发中缩影性核心核定位技术的研究

初情期苔藓原毛氏杆菌程序开发中缩影性核心核定位技术的研究

0kiss-4系统在生殖致癌物生殖中的作用喂食动物的过程是一项复杂的生理过程，取决于中枢神经系统和内政部系统的规则、速度和限制。脑-垂向-腺体轴（hpg）相互协调、相互制约。在HPG的生殖调控作用中,作为生殖活动的调控中枢,下丘脑能够接收体内、外环境变化的信号,相应调节促性腺激素释放激素(GnRH)的分泌,从而调控生殖活动,因此,下丘脑GnRH分泌的调节在哺乳动物的生殖调控中起着至关重要的作用。多年来,科学家们一直在寻找GnRH分泌的调节物,2003年人们意外地发现KiSS-1GPR54系统在人和小鼠初情期的启动上起着关键的“把门”作用,这一重大发现揭开了人们对哺乳动物生殖内分泌调控机制研究的新篇章。KiSS-1/GPR54系统由KiSS-1基因编码的产物Kisspeptin及其特异性受体-G蛋白偶联受体54(Gprotein-coupledreceptor54,GPR54)组成。最近,一系列研究表明KiSS-1GPR54系统主要在下丘脑表达,能接收体内外信息进而调节下丘脑GnRH的分泌,对哺乳动物生殖内分泌起着中枢调控作用。本研究采用免疫组织化学技术对Kisspeptin在初情期前母羊下丘脑的分布定位进行研究,旨在明确Kisspeptin在初情期前母羊下丘脑的分布定位,不仅为阐明KiSS-1/GPR54系统对母羊生殖内分泌的作用机制奠定基础,而且也为Kisspeptin在母羊生殖调控上的应用提供参考资料。1材料和方法1.1试验处理与分组将3只3月龄的雌性小尾寒羊颈动脉放血致死,迅速割下头部,通过颈动脉灌注37℃生理盐水来冲净血液,后灌注4℃的4%的多聚甲醛磷酸缓冲液,开颅取脑,切取下丘脑,浸入上述固定液中后固定12h。之后浸入4℃的20%蔗糖PB液,组织块沉底后用OCT包埋剂进行包埋冷冻后,用冰冻切片机(德国,LeicaCM1850)对下丘脑做冠状连续切片,厚度为40μm。每只羊下丘脑制得两套切片,一套做Nissl染色以确认下丘脑核团位置,部分用作阴性对照实验;一套进行免疫组化SP法染色。1.2家兔抗学体基因型小鼠血清中变化的检测采用兔抗Kisspeptin-10多克隆抗体(购自美国Millipore公司)、抗兔SP超敏试剂盒和DAB显色试剂盒(均购自福州迈新生物技术开发有限公司)进行免疫组化试验。将切片用0.01mol/L的PBS冲洗3次,每次l0min。(1)切片入A液(过氧化物酶阻断剂),室温下孵育30min后,用0.0lmol/L的PBS充分漂洗;(2)入B液(非免疫血清),室温下孵育30min;(3)加入兔抗Kisspeptin-10抗体(稀释倍数为1:1500),4℃下孵育72h后,用PBS充分漂洗;(4)入C液(生物素标记的二抗0,室温下孵育25min,用PBS充分漂洗;(5)入D液(链霉素抗生物素蛋白一过氧化物酶),室温下孵育25min,用PBS充分漂洗;(6)用DAB处理,室温下呈色,观察直至有棕红色反应产物出现为止,冲洗,终止反应,PBS冲洗、贴片、室温晾干;(7)切片脱水、透明、封片、光镜下观察。阴性对照实验:用0.0lmol/L的PBS代替兔抗Kisspeptin-10抗体孵育切片,其余步骤同上。1.3图像分析将制得的切片在Olympus显微镜下观察记录并拍照。2peptin表达Kisspeptin在母羊下丘脑各神经核团的分布定位见图1。Kisspeptin在下丘脑的分布主要集中在弓状核,室旁核、后核、乳头体内侧核、乳头体外侧核,血管附近、正中隆起和部分神经纤维也分布有少量Kisspeptin阳性反应物质,而在前腹侧室周核分布极少。免疫神经纤维的形态主要有梭形、椭圆形和多边形。Kisspeptin在下丘脑的具体分布如下:弓状核,Kisspeptin阳性反应神经元在弓状核分布较多而且密集,阳性反应神经元呈卵形、圆形和三角形,以卵形为主且多为大型细胞(图1A);室旁核,室旁核上Kisspeptin阳性反应神经元分布集中,神经元胞体多为卵形或圆形。室旁核的神经纤维中也分布有Kisspeptin免疫阳性反应物质(图1B);下丘脑后核,下丘脑后核的Kisspeptin免疫反应阳性神经元多呈三角形和卵形,树突清晰可见,以中、小型细胞为主(图1C);乳头体内侧核,乳头体内侧核免疫阳性神经元多为三角形和卵形,以小型细胞为主(图1D);乳头体外侧核,乳头体外侧核免疫阳性神经元多为圆形,且以小细胞为主(图1E);正中隆起,正中隆起部位的免疫阳性神经元多为卵圆形,以大型细胞为主(图1F);视上核,视上核免疫阳性神经元多为三角形和卵形,多为中型细胞(图1G);前腹侧室周核,前腹侧室周核的免疫阳性神经元多为卵圆形,以小细胞为主(图1H);血管和神经纤维,血管和部分神经纤维中也含有Kisspeptin免疫反应阳性物质(图1I、J)。3不同种属对嘴唇kiss-1基因表达的影响本研究结果表明Kisspeptin主要分布于母羊下丘脑的弓状核,在前腹侧室周核分布极少,而前人研究表明Kisspeptin主要分布于啮齿类动物下丘脑的弓状核和前腹侧室周核,这种差异说明Kisspeptin在下丘脑的分布定位存在种属差异,研究结果也提示不同种属动物下丘脑KiSS-1基因对生殖内分泌调节的作用部位和机制可能不同,需要进一步深入研究。4关于rsspeptinKisspeptin作为GnRH的上游调控元件,研究其在下丘脑各神经核团分的布定位对阐明Kisspeptin在生殖内分泌中的作用机制具有重要意义。KiSS-1基因编码的前体是由145个氨基酸组成的亲水性蛋白质,在体内Kisspeptin被水解为54个氨基酸构成的分泌肽,称为Kisspeptin-54,因其具有抗肿瘤转移的作用,也称为转移抑素(metastin)。Kisspeptin-54经过不同蛋白加工形式能形成含有14、13或10个氨基酸的产物,分别称为Kisspeptin-14、-13和-10,它们的碳末端都有-Arg-Phe-NH2序列,因此具有相似的生物学活性和功能,统称为Kisspeptins。本试验利用Kisspeptin-10抗体进行下丘脑的免疫组化研究,因此,研究结果能真实反映Kisspeptin在下丘脑的分布定位。试验研究表明Kisspeptin主要分布在初情期前母羊下丘脑的弓状核,这与Pompolo等对成年母羊的研究结果一致。对啮齿类动物的研究表明Kisspeptin主要分布在下丘脑的前腹侧室周核和弓状核,而下丘脑的弓状核和前腹侧室周核一直被认为是性腺类固醇激素对GnRH分泌反馈调节的重要位点。随后的研究证实了性腺类固醇激素对啮齿类动物GnRH分泌的正反馈和负反馈