加工性应激源诱导大鼠脑内表达的实验研究

加工性应激源诱导大鼠脑内表达的实验研究

经典的应激反应可以导致大脑-肾上腺皮质（hpa）轴的反应。应激的中枢调控机制还在探索中。c-fos表达作为神经元兴奋的标志是近年来出现的研究脑内解剖通路的一种常用方法。已有不少报道用c-fos表达来研究脑内参与应激的神经核团。这些研究大多采用单一的应激源如束缚、制动、高渗刺激等。在实际情况下,应激因素通常是复合存在的。有关复合应激源激活脑内通路的研究,目前还很少。Bouaz等研究观察到,冷束缚应激可以引起边缘系统、室旁核、蓝斑等核团的Fos表达。而对于水浸束缚应激脑内通路的研究尚未见报道。本实验即以c-fos的表达为的为指标,观察水浸束缚复合应激时被激活的脑内核团,并与电击足底单一应激源进行比较,以探讨复合应激时HPA轴的中枢调控机制。1材料和方法1.1实验动物中心实验动物用成年Wistar雄性大鼠,体重200～250g,由苏州医学院实验动物中心提供。先将大鼠在实验环境(室温:20℃,光照:0600～1800)中饲养一周,使其适应环境后再进行正式实验。1.2应激大鼠模型水浸束缚是将清醒大鼠放入狭小的有机玻璃盒内,将其竖着浸入22℃的水中,水浸到剑突处。实验设立应激1h、4h、20h三个应激组,另取同一笼饲养未经应激的大鼠作正常对照组(controll),每组6只大鼠。应激结束后立即取脑作Fos免疫组织化学观察,并取胃观察粘膜病变。电击足底应激是将大鼠放入22cm×22cm×22cm的应激笼内,刺激电流(强度4mA,持续3sec,间隔2sec)经笼底金属栅刺激大鼠足底,刺激15min。应激结束后1h取脑及胃分别作Fos免疫组织化学和胃粘膜的观察。另取同一笼饲养的自由活动大鼠作正常对照组(control2)。也是每组6只大鼠。1.3水生动物免疫反应性研究paxios大鼠应激后,腹腔注射4%的水合氯醛(10ml/kg)麻醉,依次用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.2)和4%多聚甲醛经心脏作全身灌流。取脑,放入4%多聚甲醛内固定6h,随后置入20%的蔗糖溶液中过夜。次日作连续冰冻切片,片厚60μm,隔3张取1张,作c-fos染色。按照Paxinos和Watson图谱进行核团定位。切片染色依下列步骤进行:(1)Fos抗体(1∶3000,伦敦大学DrHancock赠送)孵育16～20h;(2)生物素化羊抗兔抗体(1∶200,Vector公司)孵育1～2h;(3)亲和素-生物素试剂(1∶200,Vector公司)中孵育1～2h。每级孵育后均用PBS洗5min两次。最后用0.1%DAB溶液和0.03%H2O2呈色2～5min,清洗后贴片。室温下风干,酒精脱水,二甲苯透明,树胶封片,在25×10的光镜下观察Fos样免疫反应性(Fos-likeimmunoreactivity,FLI),并有计数器作FLI阳性细胞计数。必要时作低倍镜下的显微摄影。1.4胃粘膜的形态观察取下新鲜的胃,沿胃大弯剪开。并在解剖显微镜下计数出血点和溃疡数,进行半定量分析。1.5单因素方差分析对水浸束缚应激后前扣带回、室旁核和蓝斑的FLI阳性细胞数及胃溃疡指数进行单因素方差分析。全部数据以均数±标准误(x¯±sx¯)(x¯±sx¯)表示,用t检验检查组间的差异性。2结果2.1应激性排污的病理变化在水浸束缚应激1h组,除个别大鼠胃粘膜出现间质性水肿外,大多数未见应激性溃疡的病理变化。应激4h组动物均出现显著的出血、糜烂、溃疡,应激20h组的病变更为严重,应激4h组和应激20h组胃粘膜损伤程度显著高于正常对照组(P<0.01,图1)。电击足底应激未见胃溃疡产生。2.2室旁核和干法蓝斑lc的fli阳性细胞在水浸束缚应激的正常对照组和电击足底应激的正常对照组,边缘系统的前扣带回(ACG),下丘脑室旁核(PVN)和脑干的蓝斑(LC)都有一定数量的FLI阳性细胞。其余核团偶尔出现FLI阳性细胞或基本没有。而应激组大鼠,无论是在水浸束缚还是在电击足底应激后,边缘系统、下丘脑、脑干均有广泛的FLI表达(表1),其中以边缘系统的前扣带回,下丘脑室旁核及脑干蓝斑最为显著(图2)。2.2.1fli表达水浸束缚应激1h组在前扣带回,杏仁内侧核(Me)和前额叶皮层(Fc)见有大量的FLI阳性细胞,在应激4h和应激20h两个应激组仅有少量的FLI表达。在电击足底应激组中,除了上述核团出现大量的FLI表达外,在伏隔核及主嗅皮层也有较多的FLI表达(表1)。2.2.2fli阳性细胞的表达不同时程的水浸束缚应激和电击足底应激在室旁核均见有大量的FLI阳性细胞。此外,在下丘脑的视上核、内侧视前区等脑区以及丘脑室旁核,中央中核等广泛区域均着不同程度的FLI表达(表1)。2.2.3种核团fli表达比较水浸束缚的三个应激组,在蓝斑、孤束核(NST)、中缝背核(Dr)都有高度的FLI表达,在电击足底应激时,这三个核团也都有一定量的FLI表达(表1)。值得特别提出的是,把不同时程水浸束缚应激的结果进行比较,发现随着应激时程的延长,边缘系统各核团的FLI表达逐渐减少,而间脑、脑干的大多数核团FLI表达逐渐增强(表1)。其中以ACG、PVN、LC最为明显(图3)。3水浸束缚应激与fli的关系本实验结果显示,水浸束缚的复合应激源和电击足底的单一应激源都能激活边缘系统、间脑、脑干内许多神经核团,其中以PVN、LC最为明显。这与其它单一应激源得到的结果相类似。两者相比未见有核团表达的差异。说明,不论单一应激源,或是复合应激源,都能激活PVN-CRF和LC-NE系统,去调控HPA轴的活动,引起全身的应激反应。实验发现,随着水浸束缚应激时间的延长,边缘系统前扣带回、杏仁内侧核前额叶皮层内FLI表达逐步减弱。这可能与边缘系统的功能有关。在应激反应的早期,边缘系统参与信息的加工处理,进行认知评价,再调动PVN-CRF和LC-NE系统,去调控HPA的活动,引起全身的应激反应。根据有无边缘系统的参与,可以将应激源分为两类,一类为加工性应激源(processivestrssor),它们不对生命构成直接威胁,需要经过边缘系统的加工评价,然后作用于HPA轴。另一类为系统性应激源(systemicstressor),如缺氧等,对生命有直接威胁,通过内脏传入直接作用于HPA轴,不经过边缘系统。水浸束缚和电击足底应激本身都不对生命构成直接威胁,属于加工性应激源,所以在应激早期,边缘系统对其进行加工评价,因此FLI表达明显。由于FLI一般在接受刺激后30min开始表达,2h左右逐渐恢复到正常水平,所以观察到随着水浸束缚应激时间的延长,FLI表达反而减少。本实验还观察到,水浸束缚应激引起脑内FLI表达有另一个特点,即随着应激时间的延长,在边缘系统FLI表达逐渐减弱的同时,间脑和脑干的FLI表达逐渐增强。其中PVN和LC的FLI表达更加明显。这可能是由于在水浸束缚应激的持续作用下,不断诱导PVN和LC的FLI表达,从而使PVN-CRF与LC-NE系统的活动不断增强,以对抗应激刺激。本文观察到水浸束缚应激能导致