下丘脑室旁核微量注射ghrelin对大鼠胃运动及胃电活动的影响

下丘脑室旁核微量注射ghrelin对大鼠胃运动及胃电活动的影响

作为一种新发现的脑肠苷，ghrolin是促进下肢分泌受体（ghs-r）的内源性配体，存在于胃内伤细胞、中风、腺体垂、干预、心脏和其他外源性组织中。GHS-R广泛分布于脑及外周组织。在鼠脑,GHS-R主要位于腺垂体及下丘脑多个核团如室旁核(PVN)、弓状核等。Ghrelin与GHS-R结合后会产生一系列生物学效应,如刺激生长激素释放、增加食欲、调节能量代谢等。Ghrelin对胃运动、胃电活动的调控则报道较少。外周或侧脑室给予ghrelin可增强胃十二指肠动力。但目前尚缺乏神经核团内ghrelin对胃功能活动调控的资料。PVN是调控胃功能的重要核团,ghrelin及其受体GHS-R在PVN内的大量分布,提示PVN内ghrelin对胃功能的调节可能具有重要作用。为此,我们采用核团微量注射、应力传感器引导胃运动及银丝电极引导胃电等方法,观察了PVN内ghrelin对清醒大鼠胃运动及胃电活动的影响,并就其作用的自主神经机制进行初步探讨。1材料和方法1.1实验动物及仪器选用成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠,体重250~350g,由徐州医学院实验动物中心提供。Ghrelin,心得安(SigmaCo.USA);硫酸阿托品(上海第十制药厂);酚妥拉明(Ciba-GeigyLimitedBasle,Switzerland)。1.2动物模型的制备1.2.1胃窦腹和双极银丝电极缝贴大鼠术前禁食18h,自由饮水。8%水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉,消毒条件下开腹,距幽门0.3cm处沿环行肌方向分别将应力传感器及双极银丝电极缝贴于胃窦腹侧面和背侧面浆膜,导线经皮下引至颈部固定。1.2.2牙托水、细铜丝固定在脑立体定位仪引导下,参照Paxinos-Watson大鼠脑立体定位图谱,无菌条件下置不锈钢套管(长25mm,外径0.7mm,内径0.4mm)于一侧PVN(前囟后1.5~1.8mm,旁开0.2~0.4mm,颅骨表面下5.9~6.3mm,门齿根部低于耳间线3.3mm),以针灸针(长25mm,直径0.35mm)为套管内芯,用502胶、牙托粉、牙托水及细铜丝固定。1.2.3静脉压脉疾病消毒条件下于右颈静脉植入插管,内充肝素(1×105U/L),导管经皮下引至颈部固定。1.2.4去动脉间之感染开腹后,在距贲门5mm处的食管前后壁,切断迷走神经前、后支。在腹腔动脉、腹主动脉及肠系膜上动脉之间可见灰白色的交感神经节,用有齿眼科镊钝性分离并去除之。假手术组仅开腹后暴露迷走神经或交感神经节。1.2.5术后处理术后动物单独喂养,每天腹腔给予青霉素8万U预防感染,术后3~5天动物恢复、饮食正常后进行实验观察。1.3maclus生物信号记录大鼠禁食18h,自由饮水。将清醒动物置于特制鼠笼内,将应力传感器及银丝电极导线分别连接于ML110桥式放大器和ML132生物电放大器,通过MacLab生物信号记录系统(ADInstrumentPtyLtd.Australia)记录胃运动、胃电活动(胃运动:量程1mV、滤波20Hz。胃电快波:时间常数0.03s、滤波30Hz。胃电慢波:时间常数1s、滤波10Hz)。1.4外注射,机注射微量注射器以硅胶管与不锈钢内套管相连(外径0.30mm,长度27mm),吸取待注射药物后将内套管轻插入外套管,其尖端伸出2mm进入核团,3min内缓慢注射完毕,留针3min。1.5pvn微量注射所有动物均随机分组,按以下步骤进行实验观察。①同步记录5只大鼠胃运动和胃电活动1h,观察正常胃运动及胃电活动。②大鼠分为5组,每组5~7只:实验组(4组)PVN内分别微量注射ghrelin0.03、0.06、0.15、0.3nmol各0.5μl,对照组PVN微量注射生理盐水0.5μl。③大鼠分为4组,每组5只:迷走神经假切断组、迷走神经切断组、交感神经节假摘除组、交感神经节摘除组。每组均于PVN内微量注射ghrelin0.3nmol/0.5μl。④大鼠随机分为4组,每组5~6只:分别经颈静脉注射0.5ml生理盐水、阿托品(0.5mg/kg)、心得安(5mg/kg)及酚妥拉明(2mg/kg),3min后PVN内微量注射ghrelin(0.3nmol/0.5μl)。1.6冰液切片组实验结束后,经套管向PVN内注入0.5μl2%滂胺天蓝。麻醉后经左心室-升主动脉灌注固定后行50μm连续冠状冰冻切片。采用中性红染色法,观察脑片内套管轨迹,确定注射部位,定位不准者弃去不用。1.7统计学方法:符合以下四种主要利用MacLab系统的Chart软件,计算注射药物前后10min的胃运动及胃电(包括快波、慢波)幅度或频率的变化率。公式为:给药后幅度或频率−给药前幅度或频率给药前幅度或频率×100％给药后幅度或频率-给药前幅度或频率给药前幅度或频率×100％实验数据以x¯±sx¯±s表示,采用SPSS13.0进行统计学分析。多组间比较采用完全随机设计方差分析方法(ANOVA),多个实验组与一个对照组比较用最小显著差法(LSD),多个实验组之间比较用q检验(Newman-Keulstest);两组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。2pvn对grt-pcr胃电等重要影响因素的作用2.1正常大鼠胃运动及胃电活动正常清醒大鼠胃运动幅度为(8.25±2.93)g,频率为(4.98±0.43)Hz;胃电快波幅度为(84.06±27.29)μV,胃电慢波幅度为(0.44±0.13)mV,胃电的频率同胃运动一致。胃电慢波呈双相,胃电快波成簇出现,负载于慢波之上;胃运动与胃电活动具有同步关系,胃运动在时程上约出现在胃电活动后2s。2.2PVN内微量注射ghrelin对大鼠胃运动及胃电活动的影响PVN分别微量注射ghrelin0.03、0.06nmol后,胃窦运动幅度及胃电快波和慢波的幅度有轻度增加趋势,但与对照组相比无统计学意义(P>0.05);而PVN注射0.15、0.3nmolghrelin后,胃运动及胃电幅度呈剂量依赖性增强,且以0.3nmol组最为显著(P<0.01),胃运动及胃电快波和慢波的幅度变化率分别为(68.76±17.00)%、(57.04±17.10)%、(63.20±19.59)%;药物剂量对胃运动频率无明显影响(P>0.05)(图1、2)。2.3迷走、交感神经在PVN内注射ghrelin对大鼠胃运动及胃电活动调控中的作用在迷走神经假切断组,PVN注射0.3nmolghrelin后,胃运动及胃电快波和慢波的幅度分别增强了(60.62±20.14)%、(51.40±14.66)%、(42.30±11.11)%;迷走神经切断后,该效应被完全消除(P<0.01),胃运动及胃电的幅度变化率降至(5.50±8.49)%、(3.46±8.23)%、(5.26±9.17)%。然而,交感神经节摘除并不能阻断PVN注射ghrelin对胃运动及胃电活动的兴奋效应(P>0.05)(图3)。2.4颈静脉注射外周受体阻断剂后,PVN内注射ghrelin对大鼠胃运动及胃电活动的影响经颈静脉注射生理盐水后,PVN微量注射ghrelin0.3nmol,胃运动和胃电幅度明显增强。经颈静脉分别注射心得安、酚妥拉明后并不能阻断该效应(P>0.05);而经颈静脉注射阿托品后,PVN微量注射ghrelin后并不能引起胃运动及胃电幅度的增强,而是降至(-30.42±6.72)%、(-23.10±7.94)%、(-20.70±6.87)%(图4)。3pvn内grtelin胃运动和胃电活动的调控作用胃电慢波是在静息膜电位基础上发生的缓慢自动除极的节律性传导波,决定胃平滑肌的收缩节律;胃电快波即胃平滑肌的动作电位,发生在慢波的基础上,可触发平滑肌的收缩,其振幅和时程与胃运动的幅度和时程呈正相关。本实验观察到,胃窦蠕动波的频率与胃电慢波节律一致,胃电快波成簇发生,负载于每个慢波之上,胃运动幅度及胃电快、慢波幅度同步变化,胃电活动的增强可引起胃运动的增强。PVN对生理及应激状态下的胃酸分泌、胃运动、胃电活动和各种病因所致的胃黏膜损伤具有广泛的调节作用。Ghrelin及其受体GHS-R在PVN内的大量分布,提示PVN内ghrelin对胃功能的调节可能具有重要的作用。最近的资料发现腹腔注射ghrelin在使大鼠摄食增加的同时,可使PVN中c-Fos蛋白表达增强;PVN内微量注射ghrelin使大鼠摄食增加;ghrelin和胃动素具高度结构同源性,而PVN内注射胃动素可增强大鼠胃运动。这些均提示我们,ghrelin可否作用于PVN而影响胃运动和胃电活动?我们观察到,PVN内注射0.15、0.3nmolghrelin后,胃运动和胃电(包括快波、慢波)幅度呈剂量依赖性增强。这表明PVN内ghrelin对胃运动和胃电活动具有兴奋性作用。Gherlin的受体GHS-R是一种G蛋白耦联受体,分为Ia和Ib两型。在鼠脑,GHS1a-R除了腺垂体,主要分布下丘脑的多个核团,PVN是GHS1a-RmRNA表达最密的核团之一,而GHS1b-R在脑内的分布远较GHS1a-R局限。我们推测,PVN内ghrelin对胃运动及胃电活动的调控作用,可能是通过作用于PVN内神经元上的GHS1a-R而实现的。Ghrelin在血-脑屏障转运的程度和方向取决于其翻译后辛酰基化结构,ghrelin很少经血-脑屏障转运,而去辛酰基化ghrelin可一过性地通过血-脑屏障;并且ghrelin是一种大分子多肽,因而可以排除ghrelin通过血-脑屏障进入外周进行作用的可能。中枢内ghrelin可引起血中生长激素水平升高,然而尚没有生长激素对胃运动功能调控的报道,故认为PVN内ghrelin对胃运动和胃电活动的作用可能与生长激素的分泌无关。唐明等观察到,侧脑室或下丘脑腹内侧核注射胃动素可增强胃运动,而对收缩频率无影响,我们也注意到,PVN内注射ghrelin后胃运动频率无明显变化,其胃内机制有待于进一步研究。我们还初步探讨了PVN内微量注射ghrelin对胃运动及胃电活动影响的外周神经机制。除肠神经系统外,胃运动及胃电活动主要受到自主神经系统的支配,包括交感神经和迷走神经。交感神经为肾上腺能纤维,末梢释放去甲肾上腺素,通过α、β受体抑制胃运动和胃电活动。迷走神经主要为胆碱能纤维,末梢释放乙酰胆碱,通过M受体使胃运动增强;此外,迷走神经还含有少量非胆碱能非肾上腺素能纤维,末梢主要释放肽类递质,对胃具有兴奋性或抑制性效应。本实验观察到,交感神经节摘除或静脉分别给予肾上腺素α受体阻断剂酚妥拉明和β受体阻断剂