近红外光谱技术对人参叶总皂苷的分离纯化研究

近红外光谱技术对人参叶总皂苷的分离纯化研究

基于paxadiol的胡椒皂苷人参叶是人参科植物的一种干燥的叶子，具有益肺、害羞、生长体液的功能。用于气虚咳嗽、感冒、易怒、津伤、喉咙干渴、头晕、四肢疲劳等疾病。人参叶中含有多种皂苷类成分,其含量高于人参根。人参皂苷按化学结构可分为三类,分别是齐墩果酸型(oleanolicacid,OA),如Ro等;20s-原人参二醇型(20s-Protopanaxadiol,PPD),如Rc,Rd,Rb1-3等;原人参三醇型(20s-Protopanaxatriol,PPT),如Re,Rg1等。这三种类型的人参皂苷均有广泛的生物学活性,如抗肿瘤、抗心律失常、改善心肌缺血、抗氧化及清除自由基等作用。目前,大孔树脂已广泛用于人参总皂苷的富集纯化研究,为其工业化生产及含有人参总皂苷的中药制剂的制备提供工艺参数。中药生产过程的绝大部分环节缺乏在线检测技术,无法控制有效成分含量,导致中药产品质量无法保证。过程分析技术(PAT)是目前制药工业关注的焦点,它是一种用于设计、分析和控制药品生产过程的方法,通过及时测量原料、生产过程中的物料和工艺过程的关键质量和性能指标,以确保产品的最终质量。近红外光谱技术具有无需对样品作复杂的前处理,分析时间短等优点,是PAT的常用工具之一,在中药品质鉴定和药效成分的定量测定上得到了较多应用。采用NIR技术研究人参叶提取物皂苷类成分的大孔树脂分离纯化工艺过程,结合HPLC检测和多元统计分析方法,建立代表性药效成分人参皂苷Rg1,Re及Rb1的定量分析模型,并以三者含量的加和来表征人参总皂苷的含量,建立其定量分析模型,从而为实现人参叶总皂苷分离纯化过程的全程实时质量监控提供科学依据。1实验部分1.1仪器、试剂和相对品VECTOR22/N近红外光谱仪(德国Bruker公司),配有OPUS5.0光谱采集和处理软件;Shimadzu高效液相色谱仪包括LC-10AT高压泵,DGU-14A在线脱气机,SIL-10AD自动进样器,CTO-10AS柱温箱,SPD-10A紫外检测器,LCsolution色谱工作站(日本岛津科技有限公司);HA-202M电子天平(日本A&DCo.Ltd),SK5200LH超声仪(上海科导超声仪器有限公司),CR3i离心机(Thermoelectroncorporation)。人参叶(吉林省,批号20090422);人参皂苷Rg1对照品(中国药品生物制品检定所,批号:110703-201027),人参皂苷Re对照品(上海融禾医药科技有限公司,批号:120413),人参皂苷Rb,对照品(中国药品生物制品检定所,批号:110704-200318);D101大孔树脂(天津海光化工有限公司);甲醇、乙腈为色谱纯(美国TEDIA试剂有限公司),无水乙醇为分析纯(江苏强盛化工有限公司),去离子水(自制)。1.2提取液浓缩法称取人参叶150g,置于5L圆底烧瓶中,加12倍量50%乙醇浸泡1h,回流提取2次,每次2h,过滤,合并两次提取液,减压浓缩至1g·mL-1(相当于原药材)。取3份已处理好的D101大孔树脂各50g,分别湿法装入内径为2cm的色谱柱中,加入浓缩液50mL,吸附1h后,用去离子水洗脱至无色,再用40%乙醇洗脱并收集洗脱液,每隔5min在线采集光谱1次,共采集了185个样本。1.3rg1和rb1的hplc测定1.3.1u3000乙体内-a-水-b法色谱柱为C18柱(4.6mm×250mm,5μm,HanbonSci.&Tech.Megres);以乙腑(A)-水(B)为流动相,梯度洗脱(0～37min,21%A～24%A;37～70min,24%A～40%A),检测波长203nm,柱温35℃,进样量10μL,流速1.0mL·min-1。1.3.2标准曲线及进样分别精密称取人参皂苷Rg1,Re和Rb1对照品8.46,7.76和3.92mg置于同一2mL量瓶中,用甲醇定容至刻度,摇匀,即得含人参皂苷Rg1,Re和Rb1分别为4.23,3.88和1.96mg·mL-1的混合对照品储备液。精密量取不同体积混合对照品储备液,将其配成系列标曲溶液,按上述色谱条件进样,HPLC图见图1。以浓度(x)为横坐标,峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线,得回归方程如下:人参皂苷Rg1为y=3098599.5891x-10181.2584(r=0.9998),人参皂Re为y=3130498.0298x+2977.7755(r=0.9999),人参皂苷Rb1为y=4287541.4544x-4094.9261(r=0.9999)。结果表明人参皂苷Rg1,Re和Rb1分别在0.00529～2.115,0.00485～1.940和0.00098～0.490mg·mL-1范围内线性关系良好。将标曲最低点溶液逐级稀释后分析,当S/N≥10时的浓度即为定量限(LOQ),S/N≥3时的浓度即为检测限(LOD),结果表明人参皂苷Rg1,Re的LOQ和LOD分别约为1和0.5μg·mL-1,Rb,的LOQ和LOD分别约为0.5和0.25μg·mL-1。2结果与讨论2.1人参皂苷rg1浓度的测定将1.2中收集的样品溶液摇匀,取0.5mL,12000r·min-1离心10min,取上清,过0.45μm滤膜,取续滤液按上述色谱条件分析,结果在各自线性范围内的人参皂苷Rg1(126个),Re(90个)和Rb,(179个)的浓度范围分别为:0.00831～2.05211,0.00495～1.87616和0.00818～0.26046mg·mL-1。2.2透射光谱nir在光程1cm下,每隔5min在线采集洗脱液的透射光谱图,光谱范围12000～3700cm-1,分辨率4cm-1,每张光谱为32次测定值取平均,NIR图见图2。2.3种人参皂苷的定量分析模型在建立数学模型时,需要选择合适的光谱数据预处理方法、光谱范围和主因子数作为建模的最佳条件。分别剔除在线性范围内的人参皂苷Rg1,Re和Rb1离群样本11个,14个和18个,选择有代表性的样本103个,64个和149个作为校正集样本,用于建立三种人参皂苷的定量分析模型。利用在OPUS软件中设置的自动寻找和优化功能寻找建立模型的最佳条件,通过比较各种可能组合下预测模型的R2和RMSECV,选取R2尽可能大而RMSECV尽可能小的组合,最佳建模条件见表1,模型预测值与真实值的相关系数图见图3。2.4回收率的确定将余下的12个样本作为验证集样本,用于评价模型的预测性能。将样本的NIR图谱输入人参皂苷Rg1,Re和Rb1的校正模型,得到三种成分的NIR预测值,以NIR预测值与HPLC测定值的比值做为预测回收率。结果表明,人参皂苷Rg1,Re和Rb1的NIR预测值与HPLC测定值相关系数分别为0.9857,0.9904和0.9683,平均预测回收率分别为94.63%,94.20%和95.95%,且成对t检验结果显示p值分别为0.140,0.101和0.103,均大于0.05,表明两种方法没有统计学差异,说明3个模型预测效果良好。2.5定量分析模型的建立中药产品成分复杂,其药效是基于各类化合物的协同作用,因此不宜以某一成分的量来衡量其品质。本实验从用于建立上述定量分析模型的样本中选取同时含有三种皂苷的样本60个,将三种皂苷的浓度加和值作为总皂苷的浓度,建立总皂苷定量分析模型。模型优化方法同2.3,获得最佳建模光谱范围为12000.8～7499.8cm-1,最佳主因子数为7,R2为0.9701,RMSECV为0.0755,模型预测值与真实值的相关系数图见图4。2.6定量分析模型的预测及应用将12个验证集样本的NIR图谱输入总皂苷校正模型,将总皂苷NIR预测值与其HPLC测定值及三种皂苷预测值的加和值进行比较,分别以总皂苷的NIR预测值与HPLC测定值的比值和总皂苷的NIR预测值与三种皂苷预测值的加和值的比值做为预测回收率,结果表明,它们的相关系数分别为0.9898和0.9907,平均预测回收率分别为93.66%和98.94%,且成对t检验结果显示p值分别为0.063和0.985,均大于0.05,表明两种方法没有统计学差异,说明以三种皂苷的浓度加和值作为人参总皂苷浓度来建立的总皂苷定量分析模型准确可靠,可用来测定人参总皂苷的含量。按上述方法,制备1个批次的人参叶提取物工艺过程样品,用于进一步验证总皂苷定量分析模型的预测性能。采集样本的NIR图谱,将其输入总皂苷定量模型预测其含量,并采用HPLC法测定样本中人参皂苷Rg1,Re和Rb1的含量,以三者的浓度加和值作为总皂苷的HPLC测定值。图5为1个批次工艺过程样品的总皂苷NIR预测值与HPLC测定值的趋势图,可见其NIR预测值与HPLC测定值基本一致,且相关系数为0.9928,平均预测回收率为100.52%,表明所建立的人参总皂苷定量分析模型预测性能好,可用于在线监测人参叶提取物大孔树脂分离纯化工艺过程总皂苷的含量。3建立人参总皂苷定量分析模型采用NIR技术在线监测人参叶提取物大孔树脂分离纯化过程中人参总皂苷的浓度。从所建立的HPLC方法可知分析1个样本需要71min,而结合NIR法