质粒DNA及λDNA的酶切、连接、转化及重组子的筛选鉴定

质粒DNA及入DNA的酶切、连接、转化及重组子的筛选鉴定一、【实验目的】1、 学习在实现DNA的体外重组过程中，如何正确选择合适的载体和限制性核酸内切酶，并利用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割；2、 学会设计构建重组DNA的基本方法并掌握载体和目的DNA酶切的操作技术；3、 学习利用T4-DNA连接酶连接载体片段和目的DNA片段，构建体外重组DNA；4、 掌握利用CaCl2制备感受态细胞的原理与方法和热击法转化的原理和方法；5、 学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及迈补筛选法的原理及方法；6、 学习并掌握使用试剂盒抽提质粒的方法及进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA片段。二、【实验原理】本阶段实验采用单酶切法，用限制性核酸内切酶HindIII将上阶段实验中提取并用琼脂糖凝胶电泳验证了的大肠杆菌质粒DNApUC19和买来的入DNA同时酶切,然后用DNA连接酶将上述酶切的质粒pUC19和入DNA在有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中连接起来，得到重组质粒。之后再将重组质粒导入到用CaCl2处理的大肠杆菌DH5a感受态细胞中，经培养后，再将这些大肠杆菌涂布在麦康凯培养基中，通过a互补筛选法，根据菌洛颜色筛选出重组子，并将其划线接种于加入氨苄青霉素的麦康凯培养基中进行验证，最后大量培养，并用试剂盒提取重组DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳检测。1、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的酶。主要是从原核生物中分离纯化出来的。根据1994年美国出版的《分子生物学百科全书》的统计数字，仅II型核酸内切限制酶一项就已从各种不同的微生物当中，分离出了2300种以上、可识别230种不同的DNA序列。在核酸内切限制酶的作用下，侵入细菌的“外源”DNA分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA由于修饰酶（通常是一种甲基化酶）的保护作用，则可免受限制酶的降解。目前已经鉴定出3种不同类型的核酸内切限制酶，即I型酶、II型酶和III型酶。II型核酸内切限制酶具有3个基本的特性：①在DNA分子双链的特异性识别序列部位切割DNA分子，产生链的断裂；②2个单链断裂部位在DNA分子上的分布通常不是彼此直接相对的；③断裂结果形成的DNA片段往往具有互补的单链延伸末端。限制性内切酶的切割方式：根据切割位点相对于对称轴的位置而言有三种，在对称轴5'侧切割产生5'粘端，在对称轴的3'侧切割产生3'粘端，在对称轴处切割产生平端。核酸内切限制酶对DNA底物的酶解作用是否完全，直接关系到连接反应、重组体分子的筛选和鉴定等实验结果。核酸内切限制酶活性的充分发挥受到以下几个因索的影响：1）DNA样品的纯度，2）DNA的甲基化程度，3）酶切消化反应的温度，4）DNA的分子结构，5）核酸内切限制酶的缓冲液。内切酶的星号活性：内切酶通常有严格的识别特异性，能精确地识别Dna排列顺序。但在某些反应条件下，识别顺序的特异性可能发生变化。结果一种内切酶酶切同一种DNA片段会产生新的酶切位点，得到不同的酶切片段，这就是内切酶的星号活性。最常见的例子是EcoRI,—般条件下它识别GAATTC六个核苷酸顺序，而EcoR1（表现有星号活性），仅能识别AATT四个核苷酸的顺序。在这种条件下的酶解反应，电泳后出现的DNA条带数可能增多。促使内切酶产生星号活性的因素有多种，主要由如下一些因素引起：（1）甘油浓度过高。这是引起星号反应的常见原因。（2）离子强度不合适。盐浓度降低也可能引起星号反应。（3）阳离子变化。若将Mg2+改为Mn2+可能促使EcoRI和HindIII产生星号活性。（4）溶液中pH变化。如用EcoRI酶切时，反应溶液的pH值由7.5升高到8.5时也会出现星号反应。（5）有机溶剂残留的影响。2、酶切方法体外构建重组DNA分子，首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性核酸内切酶都不能在目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或者两种限制性核酸内切酶切割外源供体DNA时，能够得到完整的目的基因。其次，选择具有相应的单一酶切位点的质粒、噬菌体等载体分子再为克隆的载体。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。3、DNA连接酶1967年，世界上有几个实验室几乎同时发现了一种能够催化2条DNA分子之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶（ligase）。这种酶能够参与DNA裂口的修复，在一定条件下还能连接DNA分子的自由末端。连接的功能是通过合成相邻核苷酸之间的磷酸二酯键，从而修复缺口（nick）或单链的裂口（gap）。DNA连接酶能催化双链DNA片段紧靠在一起的3'羟基末端与5'磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接。目前用于连接DNA片段的DNA连接酶有E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。DNA连接酶只能催化双链DNA片段互补黏性末端之间的连接，不能催化双链DNA片段平末端之间的连接。T4DNA连接酶既可用于双链DNA片段互补黏性末端之间的连接，也能催化双链DNA片段平末端之间的连接，但平末端之间连接的效率比较低。DNA连接酶同核酸内切限制酶一样，都是在体外构建重组DNA分子所必不可少的基本工具酶。核酸内切限制酶可以将DNA分子切割成不同大小的片段，然而要将不同来源的DNA片段组成新的杂种DNA分子，还必须将它们彼此连接起来。目前有3种体外连接DNA片段的方法：①用DNA连接酶连接具有互补黏性末端的DNA片段;②用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来，或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片段加上poly（dA）-poly（dT）尾之后，再用DNA连接酶连接起来；③先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成黏性末端，再用DNA连接酶连接起来。这3种方法虽然互有差异，但共同的一点都是利用DNA连接酶所具有的连接和封闭单链DNA的功能。4、连接反应外源DNA片段与载体分子连接的方法，即DNA分子体外重组技术，主要依赖于核酸内切限制酶和DNA连接酶催化完成的。DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5'-磷酸和3'-羟基间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自T4噬菌体的DNA连接酶：T4-DNA连接酶，该酶需要ATP作为辅助因子。5、感受态细胞的制备及质粒转化构建好的重组DNA转入感受态细胞中进行表达的现象就是转化。能进行转化的受体细胞必须是感受态细胞，即受体细胞最容易接受外源DNA片段实现转化的生理状态，它决定于受体菌的遗传特性，同时与菌龄、外界环境等因素有关。人工转化是通过人为诱导的方法使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内，该过程与细菌自身的遗传控制无关，常用热击法，电穿孔法等。能否实现质粒DNA的转化还与受体细胞的遗传特性有关，所用的受体细胞一般是限制修饰系统的缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2法，制备好的感受态细胞可以加入终浓度为15%的无菌甘油，-70°C可保存半年至一年。经过CaCl2处理的细胞细胞膜通透性增加，允许外源DNA分子进入。在低温下，将携带有外源DNA片段的载体与感受态细胞混合，经过热击或电穿孔技术，使载体分子进入细胞。进入受体细胞的外源DNA分子通过复制、表达，使受体细胞出现新的遗传性状。将这些转化后的细胞在选择性培养基上培养，即可筛选出重组子。本实验以E.coliDH5a菌株为受体细胞，用CaCl2处理，使其处于感受态，然后将重组后的PUC19质粒在42C下热击90s，实现转化。6、重组子的筛选鉴定重组DNA转化到宿主细胞后，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞，同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子之后能良好增殖。并且它们是与其他大量未被转化的受体菌细胞混杂在一起。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们所期待的重组DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成非期待重组DNA分子导入所致。因此必须使用各种筛选及鉴定手段区分转化子与非转化子，并从转化的细胞群体中分离出带有目的基因的重组子。本实验中采用的方法是平板筛选法和电泳检测。抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选，而不含重组质粒DNA分子的受体菌则不能存活，质粒pUC19携带有氨苄青霉素抗性基因，在含有氨苄青霉素平板上筛选转化子。没有导入质粒PUC19的受体细胞，在含有氨苄青

霉素的平板上不生长。a互补筛选法根据菌落颜色筛选含有重组质粒的转化子，利用B-半乳糖苷酶筛选系统来选择。载体上带有一个来自大肠杆菌的lac操纵子的DNA区段,这一区段编码B-半乳糖苷酶氨基端的一个蛋白片段°IPTG（异丙基-B-D-硫代半乳糖苷）可以诱导该片段的合成，而该片段能与宿主细胞所编码的B-半乳糖苷酶羧基端的一个蛋白片段互补（a互补）。故暴露于诱导物IPTG的细菌含有编码lacZ基因的质粒可同时合成该酶的两种片段，该菌在麦康凯培养基上利用乳糖产酸生成红色菌落。将多克隆位点克隆入B-半乳糖苷酶氨基端的基因中，外源DNA插人质粒的多克隆位点后可使B-半乳糖苷酶氨基端片段灭活，从而破坏了a互补作用。带有重组质粒的细菌将产生白色菌落。利用这种筛选方法可方便地将含目的基因的重组子筛选出来。挑选在氨苄青霉素培养基上生长的白色菌落，通过扩增培养。因为许多菌落存在假阳性情况，在氨苄青霉素培养基上的白色菌落可能是导入的重组载体DNA菌落，也可能是载体自连后发生突变的菌落，所以还要鉴定转化子中重组质粒DNA分子的大小，可将重组的载体DNA提取出来，进行后续的酶切、电泳检验。如下图为质粒pUC19酶切图谱：2686怕kby质粒pUC19的酶切图谱分析2686怕kby质粒pUC19的酶切图谱分析pucw^il(2.686kb)Hindi£cgRIKpntBa/nHlAccWPsflHtndill■■■■1■SadXma\XoalOspMISphlSmal*Polylinkef三、【实验材料及仪器】菌株：E.coliDH5a培养基：LB培养基、麦康凯培养基（加入氨苄青霉素）试剂材料：酶切反应：（DNAPUC19质粒，酶切lOxbuffer,HindIII,重蒸水，久DNA。）连接反应：（酶切后的DNAPUC19质粒和久DNA，连接lOxbuffer,T4连接酶,重蒸水。）感受态细胞的制备：（0』Caj）转化：（连接液和感受态细胞，0.1MCaCl2，冰块。重组菌的挑选、检验：试剂盒（含有RnaseA的溶液I,溶液II,溶液III,HBbuffer,DNAwashingbuffer,elutionbuffer），酶切后的DNAPUC19质粒，试剂盒抽提的DNA,酶切lOxbuffer,HindIII,重蒸水，琼脂糖，TAE缓冲液。上样缓冲液，EB染液。4.仪器器材：20、200、lOOOul的枪和枪尖，1.5ml的Ep管，恒温培养箱，水浴锅,平板,三角瓶,试管,接种环,牙签,酒精灯,火柴,冰箱,离心机，电泳槽，紫外仪，PCR扩增仪四、【实验步骤】（一）酶切1、在1.5ml的Eppendorf管中依次加入酶切反应的各种成分，混匀，适当离心，使样品集中于管底；酶切反应各成分添加如表1：表1pUC19质粒及2DNA酶切反应体系载体DNA（pUC19质粒）目的DNA(ADNA)试剂体积/uL试剂体积/uLddH2O7.5ddH2O20pUC195ADNA5Hindi核酸内切酶1Hindi核酸内切酶210*Buffer1.510*Buffer3反应体系总体积15反应体系总体积30注意：加样的顺序应该是，先加ddH20，其次是10*Buffer和DNA，最后加酶。且前几步要把样品加到管底的侧壁上,加完后将其甩到管底,而酶液要在加入前从-20C的冰箱取出，并酶管放置冰上，取酶液时吸头应从表面吸取,防止由于插入过深而使吸头外壁沾染过多的酶液。取出的酶液应立即加入反应混合液的液面以下,并充分混匀。限制性内切酶的酶切反应属于微量

操作技术，无论是DNA样品还是酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性并确保样品和酶全部加入反应体系。此外，酶切反应的所有塑料制品（Eppendorf管、吸头等）必须是新的，并经过高温灭菌，操作时打开使用，操作过程不要求无菌，但要注意手和空气中杂酶的污染，因此要求环境干净，戴手套操作，尽量减少走动，缩短Eppendorf管的开盖时间。2、 将上述反应体系在37°C恒温水浴锅中反应1h以上。3、 采用琼脂糖电泳检测酶切结果4、 质粒DNA、入DNA的酶切琼脂糖电泳结果及分析94164369123456789101112131415161794164369入入DNA/HindIII酶切电泳图分析：从左到右各泳道分别为第一泳道：PUC19质粒第二、十五、十六、十七泳道：用Hindill酶切完的入DNA第三至第十四泳道：第1至第12小组Hindill酶切的pUC19质粒分析：我在第一组，所点样品在第三泳道，依稀可见三条带，从上而下依次为带1、带2、带3。对比酶切的入DNA,可知带①在2.6Kb左右，而且带1在第一泳道双螺旋质粒pUC19上方，据此判断带①为线性pUC19质粒；而带②基本上在双螺旋pUC19质粒位置，因此带②为未切开的双螺旋pUC19质粒。带3位于凝胶底部呈现比较模糊的连续带可能为未降解的小RNA分子。对比带1和带2发现，带1的亮度明显比带2大，说明酶切较为彻底，至少有60%的pUC19已被酶切，可进行接下来的连接操作。但是我这组的带1明显比第4、5、6、7、9、11、12组同学的带1暗，原因是我组在实验第一阶段提取的pUC19质粒样品浓度较低。二）连接

1、在500ul的Eppendorf管中依次加入连接反应的各种成分，混匀，可适当离心，使样品集中于管底；连接反应各成分添加如下表2:表2连接反应体系试剂体积/uL入DNA/HindIII2.0pUC19DNA/HindIII2.010*LigaseBuffer1.0ddH2O4.0T4-DNA连接酶1.0连接反应体系总体积10.0注意：加样顺序和酶切反应时一样，先加ddH20,其次是10*Buffer和DNA,最后加酶2、在16°C的恒温水浴锅中过夜反应三） 感受态细胞的制备1、用接种环从含有E.coliDH5a的培养基平板上挑取少量E.coli菌落接种到20mlLB液体培养基里，37C振荡培养过夜。接种过程及以下的转接操作均须严格无菌操作，以防污染。2、 从振荡培养箱中取出37C过夜培养物，此时的培养物较浑浊，颜色变深。按1%的接种量吸取200山转接到20mlLB培养基中，37C振荡培养2—3小时。注意吸取前应充分混匀菌液，使吸取的菌量足够。培养完成后，分别取1.5ml菌液于2个无菌的1.5mlEppendorf管中，5000rpm离心5min,弃上清液，如此重复收集菌体一次，使菌量增多。离心完后，弃上清液，吸干。3、 每支离心管中加入用冰预冷的1000ul0.1mol/lCaCl2溶液，漩涡震荡使细胞悬浮混匀，冰上放置15min,4C5000rpm离心5min；弃上清液，吸干，加入100ulCaCl2悬浮冰浴。其中吸干上清可用200ul量程枪尖达到较好吸干效果,如果用1000ul枪尖则容易将菌体吸入枪尖内,造成菌体量的损失。四） 转化1、取出制备好的感受态细胞悬液，摇匀，分别从中吸取50ul、50ul、100ul置于三个新的，已灭菌的Eppendorf管中，并编号为1、2、3,往2号Eppendorf管中加入2ul质粒Puc19，混匀。3号Eppendorf管中加入之前连接步骤中制备好的连接液。混匀。然后将这三个Eppendorf管冰浴30min；2、 30min后，将上述三个Eppendorf管取出，置于42C水浴中热击2min,然后迅速置于冰上，冰浴5min,此时质粒已经吸附到感受态细胞的表面，不能剧烈振荡，以增加转化效率；3、 向上述3管中分别加入500ulLB液体培养基，37C摇床培养1h,使受体菌恢复正常生长状态。注意每次加LB液体时均需换枪尖，防止杂菌污染感受态细胞。五） 稀释和涂布平板1、无菌操作，将转化细胞溶液按以下分组涂布平板：（1）受体菌对照管：取100ul受体菌液分别涂布含有氨苄青霉素和不含氨苄青霉素的麦康凯培养基上；（2）pUC19质粒对照组：取20ul、100ul培养液涂布于含有氨苄青霉素的麦康凯培养基；（3）重组质粒转化组：取20ul、50ul、100ul、150ul、200ul培养液分别涂布含有氨苄青霉素的麦康凯培养基，2、 当菌液完全被培养基吸收后（大约10min）倒置培养皿，于37°C恒温培养24~36h,观察菌落生长情况（红白菌落法）。3、 结果统计及分析。各培养皿内菌落生长情况如下表：各实验组在培养皿内菌落生长状况组别不含Amp培养基含Amp培养基结果说明受体菌对照组有大量白色菌落生长无菌落生长感受态细胞对氨苄青霉素敏感PUC19质粒对照组-有大量红色菌落生长PUC19质粒已导入感受态细胞，使其抗青霉素重组质粒转化组有大量红色菌落生长，少数白色菌落生长目的基因已插入质粒多克隆位点，破坏a互补作用，从而生成白色菌落根据实验结果，我组之前连接的重组质粒已基本上转化进入感受态细胞，实验结果与实验预期基本一致。六）重组子的筛选与鉴定1、取一个含有氨苄青霉素的麦康凯培养基平板，在底部划线分成2个区域；在涂有重组质粒转化组的平板上分别选取2个单个的白色转化子，用接种针划线转接到平分成2份的含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上；37C过夜培养；3、分别取3ml菌液，用Omega试剂盒抽提重组质粒DNA,具体步骤见说明书；4、琼脂糖凝胶电泳鉴定。带1带2DL5000DNAmarker56423I3J941B66574J61入DNA/Hindm对照图从左至右各泳道依次为:第一泳道:未酶切的质粒pUC19第二泳道：入DNA/Hindlll第三至第十四泳道：第一组至第12组提取的重组质粒第十五泳道:入DNA/Hindlll第十六泳道：DL5000DNAmarker第十七至第二十五泳道：各组提取的重组质粒分析:（1）我们组提取的样品点在第三泳道，与图1：从左至右依次为分析:（1）我们组提取的样品点在第三泳道，与图1：从左至右依次为pUC19、入DNA/Hindis、第3、4、5、9、11、13泳道样品、入DNA/HindmarkerHI、DL5000DNA图2：从左至右依次为第六、七、564bp，与插入片段大小非常接近。另外，重组质粒亮度与质粒pUC19的亮度相比，重组质粒的亮度约为其5倍，质粒pUC19的量为200nq，则重组质粒的量可判断为200*5=1000nq，重组质粒浓度为1000/4=250nq/ul。不过，其中第九泳道样品亮度比本组其它样品亮度稍小，其重组质粒浓度也应较小，大约为180nq/ul。（2）第六、七、八、二十泳道的样品电泳结果各条带基本在同一水平线上，从上往下可见两条比较明显的带，依次为带1,带2（如图2）。与入DNA/Hindlll对照图相比可知带1大小约为9.5kb，判断其为被酶切开而没有连接上的入DNA片段，它的亮度较小，推知其浓度较小。带2大小约为5.1kb，且它的亮度很大，推知带2就是这些组同学们提取的八、二十泳道样品、入DNA/Hind皿、DL5000DNAmarker第四、五、九、十一、十三、二十五泳道的样品基本在一条水平线上，带型亦相似，依稀可见三条带（如图1）。从上而下依次为带1、带2、带3。带1很暗，大致在入DNA/Hindill的第三条带稍下方，可判断带1大小约为5.8kb,带2较窄，较暗，估测其大小为4.5kb，带3最宽，也远比带1，带2亮，应该就是我们所要提取的重组质粒，它大致与入DNA/Hindlll的第五条带稍上方平齐，与DL5000DNAmarker的第二、三条带的中间地带平齐，据此可判断其大小约为2.5kb，而空载体质粒pUC19的大小约为1.9kb，由此判断插入片段大小约为2.5—1.9=0.6kb左右，可初步判断插入片段为入DNA/Hindlll电泳图谱中的第七条带，其大小为重组质粒，那么，这些重组质粒中所插入的外源片段大小为5.1-1.9=3.2kb，而入DNA/Hindlll酶切图谱中没有3.2kb的条带，故不可判断出插入片段为哪段。根据它的亮度约为pUC19条带亮度的4倍，据此可知，第四、五小组同学所提取的重组质粒浓度约为（200*5）/4=250nq/ul，而第六、二十组同学的样品亮度略大于第四、五组的，约为他们的1.5倍，于是他们组的重组质粒浓度为375nq/ul。（3）第十二、十四、十八、十九、二十一、二十二泳道的电泳结果大致相同（如图3）。其中最亮的那条带与第一泳道的空载体本在一水平线上，可初步判定它们是未连入外源DNA的质粒图3：从左至右依次为带12、14图3：从左至右依次为带12、14、18、19、21、22、入DNA/HindIU、DL5000DNAmarker>质粒pUC19可见亮条带，带1,带2(如图4。带2明显比带1亮，大小约为3.1kb,可判断为重组质粒，插入片段大小可计算为3.1kb-1.9kb=1.2kb，入DNA/Hindlll酶切图谱中没有1.2kb的条带，故不可判断出插入片段为哪段。将它的亮度与质粒PUC19带的亮度相比，前者约为后者的6倍，可计算重组质粒浓度约为(6*200)/4=300nq/ul。(如图4)为