氯化两面针碱对多药耐药细胞的抗癌作用

氯化两面针碱对多药耐药细胞的抗癌作用

多药残留是肿瘤化疗失败的主要原因之一。克服多药多叶药物是治疗肿瘤的一个难题。近年来,国内外学者发现了多种多药耐药逆转剂,但均因靶点单一、体内逆转效率低及毒副作用大而难以应用于临床。因此,在进一步寻找高效、低毒的MDR逆转剂的同时,从丰富的中草药资源中筛选对MDR细胞敏感的抗癌活性成分成为克服多药耐药的另一条重要途径。氯化两面针碱是我国学者黄治勋等从两面针[Zanthoxylumnitidum(Roxb.)DC.]植物的根中分离到的具有抗肿瘤活性的生物碱。据报道,其体外对Lewis肺癌、人鼻咽癌、肝癌和慢性粒细胞白血病细胞等有杀伤活性,对耐药肿瘤细胞的作用尚未见报道。我们研究发现,氯化两面针碱对人口腔鳞癌细胞(KB细胞)增殖具有抑制作用(待发表),本研究观察了其对人口腔鳞癌耐药细胞KBV200生长的抑制作用。1材料和方法1.1基因组织及仪器氯化两面针碱购自中国药品生物制品检定所(批号:110848-20001,纯度>98%);胰蛋白酶和噻唑蓝(MTT)购于美国Amresco公司;RPMI-1640培养基购于美国Gibco公司;新生牛血清购自杭州四季青生物工程公司;Hoechst33258购自北京普利莱基因技术有限公司;天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶3(caspase3)ELISA试剂盒购自奥地利MedSystemsDiagnosticsGmbH公司;RNase购自美国MBI公司;碘化丙啶(propidiumiodide,PI)购自美国Sigma公司。Epics-XLⅡ型流式细胞仪为美国BeckmanCoulter公司产品,使用MulticycleAV分析软件;Model-450酶联免疫检测仪:美国Bio-Rad公司;LeicaDMR+Q550荧光显微镜:德国莱卡公司;JEM-1200EX型透射电镜:日本电子公司;CO2培养箱:美国FormaScientificInc公司。1.2血清rpmi-1330的培养人口腔鳞癌耐药细胞株KBV200购自中科院细胞库,置37℃,5%CO2的培养箱中,用含10%新生牛血清以及青、链霉素各100kU·L-1的RPMI-1640培养液培养,培养时加长春新碱(vincristine,VCR)至200nmol·L-1以维持其多药耐药性,实验前停药1周。倒置显微镜观察细胞生长情况,0.25%胰蛋白酶消化传代,取对数生长期细胞用于实验。1.3细胞抑制浓度mic将氯化两面针碱用二甲亚砜(DMSO)助溶,用基础培养基依次倍比稀释成5个浓度的母液,调整各浓度中DMSO含量至一致。取对数生长期细胞,以每孔0.19mL(约3×103细胞)接种于96孔板培养12h,待细胞贴壁后,分别加入不同浓度的氯化两面针碱10μL,使其终浓度分别为0.75,1.5,3,6和12mg·L-1,对照组加含0.5%DMSO的基础培养基。每个浓度设4个复孔,孵育48h每孔加入10μLMTT(5g·L-1),继续培养4h后倾去培养液,每孔加入DMSO0.15mL,平板振荡器振荡5min,充分溶解蓝紫色颗粒,空白孔调零,用酶标仪以570nm和630nm双波长测定吸光度(A)值,用logit法计算半数抑制浓度(IC50)。实验重复3次,计算±s。1.4细胞氧基化反应Hoechst33258为透膜性荧光染料,可与细胞核DNA结合,故正常细胞和凋亡细胞均可被Hoechst33258着色,但是正常细胞核的Hoechst着色较浅;而凋亡细胞由于细胞体积缩小,染色质固缩浓集而呈浓染致密的亮蓝色颗粒状荧光。氯化两面针碱0,3,6和9mg·L-1与细胞作用48h后,收集细胞,用PBS洗涤,按文献方法进行染色,荧光显微镜下每组观察3张片子,每片观察3个视野,统计每个视野下100个细胞的凋亡率。1.5用女性法检测细胞cappose3的含量氯化两面针碱6mg·L-1预处理细胞48h,按照ELISA试剂盒说明书制备样品并测定caspase3含量。1.6流式细胞周期检测氯化两面针碱3mg·L-1与细胞作用0,12,24,和48h,用PBS冲洗细胞2次,按文献方法染色,用流式细胞仪检测,MultiCycleAV软件进行细胞周期分析,计算各期细胞百分率。1.7统计处理数据用x¯±sx¯±s表示,组间比较使用SPSS软件(13.0)进行单因素方差分析和Dunnettt比较。2结果2.1氯化药物对膜免疫药物细胞生长的影响如图1所示,氯化两面针碱与KBV200细胞作用48h,随着药物浓度增加,细胞存活率降低,呈浓度依赖性抑制作用(r=-0.956,P<0.01),IC50值为(2.43±0.19)mg·L-1,提示氯化两面针碱体外对KBV200细胞生长具有抑制作用。2.2胞核型荧光:背景下我国我国第一大的荧光,无染或者微细胞凋亡如图2所示,空白对照组细胞胞核染色浅,轮廓不清。经氯化两面针碱(3,6和9mg·L-1)作用48h后,各组未凋亡细胞胞核呈现弥漫均匀的浅绿色荧光,形态均一,隐约可见;而凋亡细胞皱缩变小,大小不一,胞核或胞质内浓染致密的亮蓝色荧光颗粒清晰可见,部分细胞核碎裂。统计结果表明,氯化两面针碱3,6和9mg·L-1组细胞凋亡率依次为(2.3±0.7)%,(14.0±2.5)%和(8.3±2.2)%,与对照组(1.6±0.4)%比较,6和9mg·L-1组细胞凋亡率升高(P<0.01,n=3),提示较高浓度的氯化两面针碱体外可诱导KBV200细胞凋亡。2.3h前后细胞caspase3含量的比较氯化两面针碱6mg·L-1与KBV200细胞作用48h后,细胞caspase3含量为(1.19±0.03)mg·L-1,与对照组(1.01±0.02)mg·L-1比较,有统计学差异(P<0.05,n=6)。2.4两组患者显增加的比例,除杂的2.氯化两面针碱3mg·L-1与KBV200细胞作用12h后(图3),G2/M期细胞比例明显增加,由对照组的(12.4±5.3)%增加到(50.7±4.5)%(P<0.01,n=6)。作用24和48h时,G2/M期细胞比例达(73.0±1.9)%和(75.1±3.6)%(P<0.01,n=6),表明氯化两面针碱对KBV200细胞有明显的G2/M期阻滞效应。3氯化两面针碱对治疗创伤剂-膜诱导的作用据美国癌症协会统计,每年约49万例癌症患者死亡,其中61%与肿瘤内在性耐药有关,33%与肿瘤获得性耐药有关。因此,研究克服肿瘤多药耐药具有重要的临床意义。KBV200细胞是以对VCR敏感的KB细胞为亲本,通过诱变剂甲基磺酸乙酯(ethylmethanesulfonate)刺激,然后在培养液中加入浓度递增的VCR诱导而得。在VCR200nmol·L-1时生长良好,对VCR耐药约是KB细胞的100倍,其耐药机制主要与P-糖蛋白过度表达有关,是研究多药耐药的经典细胞株。本研究结果表明,氯化两面针碱与KBV200细胞作用48h,随着药物浓度增加,细胞存活率降低,呈浓度依赖性抑制作用,提示氯化两面针碱在体外对耐药细胞KBV200生长具有抑制作用。细胞周期阻滞和凋亡是许多抗肿瘤药物的重要作用途径。Caspase家族是一大类凋亡调节基因,其中caspase3在多种刺激因子触发的凋亡程序中起最后的枢纽作用,由它激活核酸内切酶降解DNA,导致凋亡,是凋亡级联反应下游最关键的执行蛋白酶。为此,本研究进一步观察了氯化两面针碱对KBV200细胞凋亡和细胞周期的影响。结果表明,氯化两面针碱(6和9mg·L-1)与KBV200细胞作用48h,细胞凋亡率较对照组明显升高,在6mg·L-1时可使KBV200细胞caspase3含量升高,由此表明氯化两面针碱对KBV200细胞凋亡具有诱导作用。氯化两面针碱在3mg·L-1时与KBV200细胞作用12,24和48h具有明显的G2/M期阻滞效应,但代表细胞凋亡的亚二倍体峰却在各时间点均未检出,该结果与用Hoec