菠萝蜜种子中凝集素的提取及其生物学特性研究

菠萝蜜种子中凝集素的提取及其生物学特性研究

海南岛位于热带地区，拥有丰富的热带植物资源，尤其是热带果树资源。凯罗蜜是著名的水果之一。它的果肉深受人们喜爱，每年的销售额也显著增加。然而，在食用凯罗蜜后，剩下的种子被丢弃，造成了巨大的浪费和污染。研究发现,许多植物体内均含有丰富的凝集素,目前已分离鉴定的凝集素有伴刀豆凝集素、麦胚凝集素(WGA)和花生凝集素(PNA)等,种类繁多,各具特性,它们均是细胞生物学等领域研究所需的主要试剂。为了充分利用自然资源,从菠萝蜜种子中提取凝集素,我们开展了此项研究。1材料和方法1.1小鼠和动物phellus菠萝蜜(ArtocarpusheterophellusLam.)产自海南岛;C57纯系小鼠和其他动物均购自江苏省实验动物中心;3T3和L929细胞株为美国ATCC公司提供。1.2其它试剂和试剂SephadexG-100和SepharoseCL-4B为Pharmacia产品;丙烯酰胺和BSA为Sigma产品;3H-TdR为中科院上海原子核所提供,其他试剂为国产分析纯;液体闪烁计数仪为Beckman公司产品;培养板为Nunclon产品。1.3方法1.3.1材料预处理取菠萝蜜种子,60℃烘干,粉碎,且过筛备用。1.3.2ss-pc-ms-u-1e-5-4e凝集素的制备按彭建宗等的方法常规PBS抽提,硫酸铵沉淀过夜(4℃),粗提物经SephadexG-100凝胶柱过滤,获得半纯品,再经IgA-SepharoseCL-4B亲和层析柱便可获得纯的凝集素。1.3.3纯度和质量分析JL纯度采用HPLC凝胶柱(Diol-300)鉴定;分子量采用SDS电泳测定,蛋白质浓度按常规Lowry方法测定。1.3.4pb-0.5小鼠体内小鼠红血球的急性毒性试验ld50按施炜星等的方法进行,在V型血凝板上每孔加入25μl红血球缓冲液(0.075mol·L-1PB-0.75mol·L-1NaCl),pH7.2,每一孔中加入25μl样品,依次作倍比稀释,然后每孔加入25μl2%新鲜的动物红血球,振荡1min,在室温下放置1.5～2.0h,肉眼观察结果。1.3.5细胞渗透量测定取C57小鼠胸腺,无菌常规制备胸腺细胞悬于含10%小牛血清的PRMI-1640培养液中,并调整细胞浓度为5.6×106个·ml-1,在24孔板中,每孔加入悬液0.9ml和不同浓度的JL溶液0.1ml,空白对照组加入0.1ml培养液,置37℃、5%CO2培养箱中培养43h后,每孔加入1uCi3H-TdR,再培养5h后,常规膜片法收集细胞,用Beckman液闪仪测3H-TdR的渗入量(Dpm)。另外常规制备3T3和L929细胞悬液,并调定细胞浓度为5×105个·ml-1,按每孔100μl将细胞悬液加入96孔板中,同上条件培养24h后,按每孔100μl加入不同浓度的JL或等体积的培养液,培养12h后,每孔加入0.5uCi3H-TdR,再培养12h后,常规消化并收集样品,经液闪仪测3H-TdR渗入量(Dpm)。2结果2.1半纯品jl3的纯化菠萝蜜种子经PBS、(NH4)2SO4作用后,每克种子干粉能得22mgJL1(粗蛋白),JL1经SephadexG-100过滤后可获得半纯品JL2,再经IgA-SepharoseCL-4B柱亲和层析,滤液超滤,冻干成粉为纯化的JL3,JL3经HPLC凝胶柱(Diol-300)检测为单一峰(图1),从抽提到层析柱纯化为JL3,一共提纯了111.28倍,血凝活力提高16.34倍(表1),同时JL3经pH8.3的SDS检测,发现JL有两个亚基,其分子量分别为12.0kDa和14.5kDa。2.2jl对高等动物红血球的凝集作用JL可凝集小鼠、兔、猫和人(O型)的新鲜红血球,其中对猫的红血球凝集作用最灵敏,对兔不灵敏;JL的纯度越高,凝集作用越强(表2)。2.3jl对小鼠胸径、头高细度的增殖低浓度的JL对3H-TdR渗入C57小鼠胸腺细胞的量影响不大,而当浓度达到20μg·ml-1时,其渗入量却随着浓度的增大而迅速地提高,这说明JL可促进小鼠胸腺细胞的增殖;此外我们还用人胎儿胸腺细胞作试验,发现与上述结果相类似;另外JL对L929细胞的增殖是在低浓度时明显,其最适浓度为5～50μg·ml-1;然而与上述两种结果相反,JL却使3T3细胞生长受到抑制,尤其是高浓度时更明显。3凝集素的糖基化和血红蛋白专一性本试验方法简单,提取JL得率高,活力和纯度也高,在一般的实验室均可提取。由于凝集素的血凝作用是因为凝集素分子的一个亚基与血细胞表面的凝集素专一识别的糖基结合,而另一个亚基与另外一个细胞上的糖基结合,从而通过凝集素的“搭桥”作用导致红血球凝集,具有血型专一性的凝集素是该凝集素的糖结合部位识别血细胞表面血型抗原决定簇并与之结合的结果。JL血凝作用不显示供血动物专一性,提示它所识别的糖基可能是在各种动物细胞中都存在,而且细胞上的这类糖基可能是保守的,它们在进化过程中未被淘汰。但由于我们测定的血细胞种类较少,所以这只能是一种推测。JL可促进胸腺细胞的增殖,同时低浓度的JL也可促进L