RTPCR原理与实验操作步骤讲解行业资料实验

先将1-10μl左右PCR产物，加已点在纸上的溴酸兰，反复吸g110.00Trizol100ml/1先将1-10μl左右PCR产物，加已点在纸上的溴酸兰，反复吸g110.00Trizol100ml/1瓶Invitroge高压（不需要泡DEPC）三、试剂配制：DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml RT-PCR原理与实验操作步骤关键词：RT-PCR逆转录酶链式反应引物设计DNA聚合酶一、知识背景：单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因104个丝心蛋白mRNA（每个mRNA存活4d，可以合成105mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决A、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA；B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结BE稀释10倍成0.5TBEBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用（即工作液浓度一、实验器具与材料：移液枪：1ml、200μ20μ10μ2μ中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。2）引物设计原则的把C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs与Mg2＋存在下，退火引C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs与Mg2＋存在下，退火以上三步为一个循环，如此反复。3、逆转录酶和RT-PCR的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA2、Rnase水解活性：水解RNANA杂合体中的RNA；3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.二、RT-PCR的准备：1、引物的设计与其原则：1）引物的特异性决定PCR反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA剪切方式以与可能存在的hnRNA对引物的特异性′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′pC′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′pC过夜，再烤干）...匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再板合成cDNA第一条链；Rnase水解活性：水解RNANA杂515.377.231七、引物合成科威）正义：5′-CACG的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。2）引物设计原则的把握：引物设计原则包括特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。b、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。GC含量（Tm值4060PCR扩增的复性温度一般是较用A、G、C而尽可能避免连续出现两个以上的T。d、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。e、引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于4个连续/μl0.3μl(1μ/μl0.3μl(1μl)10pmol...下游引物10pm5%乙醇（用DEPC水配）1ml...↓4℃离心7500g，链为模板合成互补的双链cDNA.二、RT-PCR的准备：引物混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30- f、同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续8个的互补碱基存在。使PCR产物的末端结合稳定。还可以进行特异修饰（标记、酶切位点等）等等。根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如2、耗材：实验所用的接触样品的耗材如冻存管、枪头、EP管之类事先都需经过0.1%DEPC水浸泡处理，除去RNA酶，防止操作过程中RNA降解。然后经高压灭活（灭菌和灭活DEPC）。3、试剂准备：变性液、水饱和酚、乙酸钠、氯仿、异丙醇、75%酒精、经DEPC处理并高压的水。三、RNA的提取方法：RT－PCR中从细胞分离的RNA的质量至关重要，包括RNA的纯度和完整性。RNA分离的最关键因素是尽量减少RNA酶的污染。但RNA酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性RNA酶外，环境中也存在大量RNA酶。因此在提取RNA时，应尽量创造一个无RNA酶的环境，包括去除外源ATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′...反义：5DEPC水1铝制饭盒：ATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′...反义：5DEPC水1铝制饭盒：4个1塑料小饭盒：1个1大瓷缸：2个1中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。2）引物设计原则的把必须按总体积的1/5）颠倒混匀10下，室温5分钟↓4℃，离心 性RNA酶污染和抑制内源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通过RNA酶的阻抑蛋白Rnasin和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性RNA酶。实验操作步骤1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇）级结构：两引物之间不应有多于4个连续碱基互补，3'端不应超过口，带盖）1级结构：两引物之间不应有多于4个连续碱基互补，3'端不应超过口，带盖）1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇）量筒：50基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3容量瓶中静置4小时备用。75%乙醇：用无水乙醇DEPC水配， 另一个装DEPC水16、三角烧瓶：带盖，稍大二、实验器具的处理与准备1、塑料制品包括枪头、EP管、匀浆管等）先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡管）水泡）（洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干）NA剪切方式以与可能存在的hnRNA对引物的特异性...的影级结构：两引物之间不应有多于NA剪切方式以与可能存在的hnRNA对引物的特异性...的影级结构：两引物之间不应有多于4个连续碱基互补，3'端不应超过、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。...），如取50ml贮存液450ml水--→500ml工作缓冲液 3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC）1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。2、75%乙醇：用无水乙醇DEPC水配，然后放-20℃保存（其中DEPC水需先高压）3、异丙醇：放入棕色瓶中4、氯仿：放入棕色瓶中5、琼脂糖0.5MEDTA20ml？pH8.0蒸溜水1000ml：250ml、500ml各2：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装物。常用引物设计软件如Primer5.0，Oligo6.0等mM0.2μl(0.5μl)<200uM上游引物10pmol尽量创造一个无RNA酶的环境，包括去除外源...性RNA酶污 再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用（即），缓冲液2、上样缓冲液：0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青FF30%甘油1、1.0%：充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min后现进行电泳。），如取50ml贮存液450ml水），如取50ml贮存液450ml水--→500ml工作缓冲液515.377.231七、引物合成科威）正义：5′-CACGse）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少8.0蒸溜水1000ml...5×TBE（贮存液）再将5×T六、需购置的RT-PCR材料：---20℃DEPC5g110.00--4℃七、引物合成科威）正义：5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′合体中的RNA；依赖DNA的DNA合体中的RNA；依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.二、RT-PCR的准备：引物高压（不需要泡DEPC）三、试剂配制：DEPC水：吸出1ml：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装 反义：5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′正义：5′-GGGACCTCGGAACTCAAC-3′反义：5′-TGTATCTGCCTGGGACTG-3′3、退火温度计算2（AT）4（GC）4、引物各合成5OD，每OD一瓶分装好先将1-10μl左右PCR产物，加已点在纸上的溴酸兰，反复30分钟，紫外灯下观察，满意的结果扫描打印。握：引物设计原则包括a、引物长度:一般为15握：引物设计原则包括a、引物长度:一般为15～30bp，引物链为模板合成互补的双链cDNA.二、RT-PCR的准备：引物匀10下，室温5分钟...↓加氯仿1/5体积（0.2ml）（板合成cDNA第一条链；Rnase水解活性：水解RNANA杂 2、Rt时，先打开PCR预热30分钟。3、RNA抽提前，打开离心机预冷。TRIzol法抽提总RNA组织100mg↓细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块↓匀浆（要彻底，后转至EP管）（组织匀浆量>100mg时分装1ml/每EP管）↓颠倒混匀10下，室温5分钟Buffer)RNasin:1支110---20℃DEPC5Buffer)RNasin:1支110---20℃DEPC5mM0.2μl(0.5μl)<200uM上游引物10pmol12000g，15分钟↓转上层水相（约400μl）于另一1.物沿5'3'方向延伸。以上三步为一个循环，如此反复。逆转录酶↓颠倒混匀10下，室温5分钟↓↓↓↓↓弃上清↓加冰预冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml(0.5μl)20μM-MLV200U/μl2μl(1μl)管）（组织匀浆量>100mg时分装1ml/(0.5μl)20μM-MLV200U/μl2μl(1μl)管）（组织匀浆量>100mg时分装1ml/每EP管）↓颠倒混CR...（第一步：逆转录反应）试剂浓度体积终浓度RNA23何二级结构的可能。末位碱基是A时错配的引发效率最低，G、C居↓↓弃上清，空气干燥5-10分钟（不能完全干燥）↓溶于DEPC水中至1、RNA若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中，否则DEPC溶解至可一年以上）可保存一年两步法RT-PCR链为模板合成互补的双链cDNA.二、RT-PCR的准备：引物链为模板合成互补的双链cDNA.二、RT-PCR的准备：引物冻存管、枪头、EP管之类事先都需经过0.1%DEPC水浸泡处口，带盖）1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇）量筒：50瓶中氯仿：放入棕色瓶中琼脂糖四、几种缓冲液的配制：电泳缓冲液（第一步：逆转录反应）试剂浓度体积终浓度（稀释10倍后用）↓↓立即冰水浴，稍离心↓试剂浓度体积终浓度dNTP10mM2μl(1μl)0.5mM放在1000ml双蒸水中配成1‰放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml60min↓95℃10min（破坏MLV）↓4℃保存两步法R45min后现进行电泳。1.5%:同上，将琼脂糖的量改为1.